黄胸鼠Ldha基因的克隆、原核表达及酶学性质研究

作者：倪玉芳; 张树军; 方天星; 万军; 陈洁; 曾凡才^*

来源：四川动物, 2021, 40(06): 601-610.

• 黄胸鼠
• Ldha基因
• 原核表达
• 蛋白纯化
• 酶学性质

Ldha基因表达可生成参与糖代谢的乳酸脱氢酶(LDH),通过克隆黄胸鼠Rattus tanezumi的Ldha基因并进行原核表达后可以研究其酶学性质。以黄胸鼠骨骼肌cDNA为模板,通过RT-PCR技术获得黄胸鼠Ldha基因编码序列,进行生物信息学分析后构建pET28α-Ldha重组表达质粒,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达,采用SDS-PAGE和Western Blot对表达蛋白进行鉴定,最后检测表达蛋白的酶学性质。结果显示,黄胸鼠Ldha基因编码区序列被成功克隆,纯化后的原核表达蛋白分子量约为37 kD,Western Blot证实后,分别以丙酮酸和乳酸为底物测得酶的平均比活性为113.760 U·mg-1±1.463 U·mg-1和2.180 U·mg-1±0.125 U·mg-1,琼脂糖凝胶电泳同工酶谱分析显示该蛋白具有LDH活性且仅形成1条同工酶带。在pH7.0,25℃条件下,LDHA蛋白对丙酮酸、NADH、乳酸、NAD+ 4种底物的平均Km值分别为0.170 mmol·L-1±0.193 mmol·L-1、0.088 mmol·L-1±0.008 mmol·L-1、22.540 mmol·L-1±0.007 mmol·L-1、0.413 mmol·L-1±0.069 mmol·L-1。黄胸鼠Ldha基因编码序列被首次克隆并表达出具有活性的酶蛋白,分析了其酶学性质,可为后续研究啮齿类动物LDH的结构和功能提供基础资料。

• 单位
  西南医科大学; 基础医学院