GATA1s敲除hPSCs模型构建与造血分化影响初探

作者：李霞; 李晓红; 周涯; 马峰; 张勇刚^*

来源：生命的化学, 2023, 43(03): 443-453.

DOI：10.13488/j.smhx.20230212

• GATA1
• GATA1s
• 多能干细胞
• 基因敲入技术
• 聚簇规则间隔短回文重复序列
• CRISPR相关蛋白
• 造血分化

本文建立了GATA1s敲除人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)细胞株，并以此为模型探讨了GATA1s缺失对体外诱导造血分化的影响。本文通过构建含有重组臂-敲入片段(GATA1外显子Ⅱ-Ⅵ序列及BGH polyA序列)-LoxP-潮霉素筛选标记-LoxP-重组臂的打靶质粒和含有gRNA-Cas9的gRNA质粒对hPSCs进行基因编辑以敲除GATA1s。通过第一步电穿孔将以上质粒导入细胞，潮霉素初步筛选7 d后的阳性克隆进行下一步电穿孔环化重组酶(Cre)使LoxP位点特异性重组以去除筛选标记，通过单细胞克隆的方式进一步培养，PCR及测序鉴定出正确基因编辑细胞，最后通过蛋白质免疫印迹验证其GATA1与GATA1s蛋白的表达情况，验证敲除GATA1s后的细胞株进行体外诱导造血分化，发现其CD34+、CD43+及CD45+细胞增多，但GPA+、CD41a+及CD42b+细胞显著减少，通过转座子系统过表达GATA1也不能挽救其减少的GPA+、CD41a+及CD42b+细胞。本研究建立了GATA1s敲除hPSCs细胞株，并发现其在造血分化时有重要作用。

• 单位
  中国医学科学院北京协和医学院