靶向人血管内皮生长因子A基因小片段干扰RNA慢病毒载体的构建、比较及鉴定

作者：姜小飞; 叶芬; 石理; 陈曦; 朱卫民; 张业明

来源：华西医学, 2016, 31(01): 1-6.

• RNA干扰
• 血管内皮生长因子
• 慢病毒
• 人脐静脉内皮细胞

目的构建人血管内皮生长因子(VEGF)m RNA靶向小片段干扰RNA(si RNA)表达的慢病毒载体,并测定其对VEGFA基因的沉默率,选择效率最高的干扰序列。方法设计3种人VEGFA靶向的发夹样si RNA(KD 1、KD 2、KD 3),分别2条互补的寡核苷酸链,退火后连接入p GCSIL-GFP载体,转化扩增后得到重组载体p GCSIL-GFP-si VEGFA,进行测序。将重组载体与慢病毒包装辅助质粒p Helper 1.0和p Helper 2.0通过Lipofectamine 2000共同转染至细胞人胚肾细胞株(293 T),产生病毒后,再转染至人脐静脉内皮细胞(HUVEC),逆转录-聚合酶链反应法检测转染细胞VEGFA m RNA的表达水平,比较3种si RNA序列的效率。结果经过酶切鉴定与测序,p GCSIL-GFP-si VEGFA构建成功。转染至HVUEC后,细胞VEGFA m RNA表达水平均明显降低(KD 1:0.614±0.043;KD 2:0.334±0.030;KD 3:0.201±0.015),其中以KD 3为相对最有效的si RNA序列。结论成功构建了针对VEGFA m RNA的si RNA载体,并可以显著抑制内皮细胞VEGFA m RNA的表达。

• 单位
  珠海市人民医院