293T细胞中SQSTM1/p62-GFP的表达及其与LC3在诱导自噬状态下的定位分布

作者：游金; 杨光铭; 徐丽明; 罗达; 卢春花^*

来源：基因组学与应用生物学, 2021, 40(01): 400-405.

DOI：10.13417/j.gab.040.000400

• p62/SQSTM1
• LC3
• 293T
• 细胞自噬

为探究SQSTM1/p62蛋白在细胞发生自噬时的定位,以人肺腺癌A549细胞的cDNA为模板,PCR扩增SQSTM1基因(编码p62蛋白)并将其插入pEGFP-N1真核表达质粒。将重组质粒转染进入人胚肾293T细胞中表达p62绿色荧光融合蛋白(GFP-p62),利用Earle’s盐平衡溶液饥饿诱导细胞自噬,Western blotting和激光共聚焦显微镜检测GFP-p62的表达及其与自噬相关蛋白LC3在自噬细胞中的定位。结果发现,重组载体pEGFP-N1-p62转染293T细胞后,293T细胞能高效表达GFP-p62融合蛋白,内源性p62所占细胞内总p62比例很低。饥饿诱导后细胞自噬体形成,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例明显增高,p62蛋白表达下调。同时还发现,GFP-p62在自噬细胞中仅定位于大多数自噬体且与LC3共定位,小部分自噬体及自噬体以外区域没有明显GFP-p62分布。本研究建立了一种通过p62-GFP与LC3的共定位检测人胚肾293T细胞自噬时p62蛋白和LC3聚集体的有效方法,提示了使用内源性p62低表达细胞作为研究p62和细胞自噬的优势,也将有助于开展关于p62在细胞中定位与其生物学功能关系的研究工作。

• 单位
  广西大学