腺相关病毒载体工程毒株精细化纯化

作者：高强^*; 宁毅; 熊涛; 胡珏; 聂娟; 李玲; 肖荣

来源：微生物学通报, 2021, 48(11): 4468-4476.

DOI：10.13344/j.microbiol.china.210189

• 腺相关病毒
• AAV-293细胞
• 层析柱
• 纯化

【背景】大量制备高纯度的重组腺相关病毒(Recombinant Adeno-Associated Virus,rAAV),是以腺相关病毒(AAV)为投递载体的基因靶向治疗或基因工程药物研发过程中需要解决的重要问题。【目的】利用层析柱法大量纯化质粒和rAAV细胞培养液,以获得高纯度的rAAV颗粒。【方法】对组装rAAV的3种质粒用HiPrepTM10 Sepharose 6FF和HiTrap PlasmidSelect Xtra凝胶层析柱纯化,目的是得到组装AAV的超螺旋质粒DNA,然后对组装rAAV过程中的AAV-293细胞培养方法进行优化,组装成功病毒后,再对收集到的细胞提取液用HiLoadTM10Q和HiLoadTM10SP阴阳离子交换层析柱纯化,最后用纯化浓缩后的rAAV感染HT1080细胞,通过流式细胞仪检测荧光表达细胞数,计算浓缩后活病毒感染滴度。【结果】HiPrep和HiTrap层析柱纯化后得到大量高纯度的超螺旋质粒DNA,组装病毒后,用HiLoad柱纯化获得大量高纯度的rAAV颗粒,通过测定,rAAV基因组滴度达到(2.46±0.37)×1012 TCID50/mL (MOI=1.0×104)。【结论】通过一系列精细化组装纯化制备出高纯度、高滴度rAAV病毒颗粒。

• 单位
  湖南中医药大学