肝癌中星形细胞上调基因1作用于microRNA－885－5p/基质金属蛋白酶9信号通路促进肝癌转移的机制研究

作者：李聪; 邢秀亚; 张巍; 李京华; 王璇; 张洪海; 杨耿侠; 生守鹏; 孙玉; 袁春旺; 郑加生^*

来源：中华消化外科杂志, 2016, 15(02): 161-167.

DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-9752.2016.02.010

• 肝肿瘤
• 转移
• 星形细胞上调基因－1
• microRNA－885－5p
• 基质金属蛋白酶9

目的探讨星形细胞上调基因-1(AEG-1)与microRNA-885-5p的关系, 观察microRNA-885-5p对肝癌细胞MHCC-97H迁移和侵袭能力的影响, 鉴定microRNA-885-5p的靶基因, 揭示AEG-1促进肝癌转移的机制。方法采用实验研究方法。构建AEG-1过表达质粒, 合成沉默AEG-1的siRNA, 分别瞬时转染进MHCC-97H细胞。对于转染质粒, 以转染空载体Vector NC的MHCC-97H细胞作对照, 设为A组;转染AEG-1过表达质粒的MHCC-97H细胞设为B组。对于转染AEG-1 siRNA, 以转染阴性对照siRNA的MHCC-97H细胞作对照, 设为C组;转染AEG-1 siRNA的MHCC-97H细胞设为D组。采用荧光定量PCR分别检测A、B、C、D组MHCC-97H细胞中microRNA-885-5p相对表达量。对于转染microRNA-885-5p模拟体, 以转染阴性对照microRNA模拟体的MHCC-97H细胞作对照, 设为E组;转染microRNA-885-5p模拟体的MHCC-97H细胞设为F组。采用Transwell小室法检测E、F组MHCC-97H细胞迁移和侵袭能力。采用Targetscan软件, 预测microRNA-885-5p的靶基因。将靶基因报告质粒和阴性对照siRNA共转染进MHCC-97H细胞作对照, 设为G组;将靶基因报告质粒和microRNA-885-5p模拟体共转染进MHCC-97H细胞, 设为H组。将结合位点突变的靶基因报告质粒和阴性对照siRNA共转染进MHCC-97H细胞作对照, 设为I组;将结合位点突变的靶基因报告质粒和microRNA-885-5p模拟体共转染进MHCC-97H细胞, 设为J组。检测G、H、I、J组细胞荧光素酶活性。在MHCC-97H细胞中转染阴性对照siRNA, 设为K组;转染microRNA-885-5p模拟体, 设为L组, 采用Western blot检测各组中microRNA-885-5p靶基因蛋白相对表达量。将microRNA-885-5p靶基因siRNA转染进MHCC-97H细胞, 设为M组;将阴性对照siRNA转染进MHCC-97H细胞, 设为N组。采用Transwell小室法检测M、N组MHCC-97H细胞迁移和侵袭能力。符合正态分布的计量资料以±s表示, 两组间比较采用t检验。结果 A组MHCC-97H细胞中microRNA-885-5p的相对表达量为(10.68±1.32)×10-4, B组为(5.02±0.20)×10-4, 两组比较, 差异有统计学意义(t=7.357, P<0.05)。C组MHCC-97H细胞中microRNA-885-5p的相对表达量为(11.04±0.97)×10-4, D组为(24.15±3.71)×10-4, 两组比较, 差异有统计学意义(t=5.920, P<0.05)。MHCC-97H细胞迁移实验结果:E组Transwell小室下层MHCC-97H细胞数目为(1 452±212)个, F组为(778±95)个, 两组比较, 差异有统计学意义(t=5.018, P<0.05)。MHCC-97H细胞侵袭实验结果:E组Transwell小室下层MHCC-97H细胞数目为(1 237±238)个, F组为(470±70)个, 两组比较, 差异有统计学意义(t=5.353, P<0.05)。预测到一条靶基因候选者为MMP9。G组MHCC-97H细胞荧光素酶活性为0.73±0.03, H组为0.46±0.04, 两组比较, 差异有统计学意义(t=8.623, P<0.05)。检测到结合位点突变报告质粒mutMMP9。I组MHCC-97H细胞荧光素酶活性为0.69±0.03, J组为0.64±0.08, 两组比较, 差异无统计学意义(t=0.934, P>0.05)。K组MHCC-97H细胞中MMP9蛋白相对表达量为0.75±0.03, L组为0.25±0.03, 两组比较, 差异有统计学意义(t=19.086, P<0.05)。MHCC-97H细胞迁移实验结果:M组Transwell小室下层MHCC-97H细胞数目为(1 210±163)个, N组为(537±16)个, 两组比较, 差异有统计学意义(t=7.111, P<0.05)。MHCC-97H细胞侵袭实验结果:M组Transwell小室下层MHCC-97H细胞数目为(1 192±170)个, N组为(374±55)个, 两组比较, 差异有统计学意义(t=7.916, P<0.05)。结论 AEG-1负调控microRNA-885-5p的表达, microRNA-885-5p的靶基因为MMP9, micro-RNA-885-5p通过负调控MMP9, 起到抑制肝癌细胞迁移和侵袭的作用。

• 单位
  解放军总医院; 首都医科大学附属北京佑安医院