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摘要
目的利用生物信息学技术分析西妥昔单克隆抗体(以下简称单抗)耐药结直肠癌细胞中环状RNA circ0008274的表达水平, 探索其参与西妥昔单抗耐药发生的机制。方法采用人结直肠癌细胞DiFi和Caco-2, 设立10、50、100、150、200 nmol/L 5个西妥昔单抗浓度点, 通过浓度递增法筛选并建立西妥昔单抗耐药结直肠癌细胞DiFi-R、Caco-2-R, 采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测DiFi-R、Caco-2-R细胞与DiFi、Caco-2细胞中circ0008274的表达水平。运用双萤光素酶报告基因分析circ0008274与miR-140-3p的偶联调控关系。采用免疫印迹法验证与西妥昔单抗耐药相关的高表达基因SMARCC1的蛋白质表达水平。采用si-circ0008274转染方法敲除DiFi-R、Caco-2-R细胞中的circ0008274, 比较敲除前后的DiFi-R、Caco-2-R细胞的增殖活性和克隆形成数。将miR-140-3p模拟物和空白对照微RNA分别转染至DiFi-R、Caco-2-R细胞, 比较转染miR-140-3p模拟物与转染空白对照微RNA的DiFi-R、Caco-2-R细胞增殖活性。分析敲除circ0008274后的Caco-2-R细胞在pcDNA3.1 SMARCC1营救前后SMARCC1蛋白质水平和细胞增殖活性。纳入2019年3月至2020年8月于武汉大学人民医院住院接受西妥昔单抗治疗的15例结直肠癌患者的肿瘤标本, 根据患者的治疗效果分为敏感组(11例)和耐药组(4例);通过RT-PCR分析两组患者结直肠癌组织中circ0008274、下游SMARCC1和miR-140-3p的相对表达水平。统计学方法采用独立样本t检验。结果 circ0008274在DiFi-R细胞中的表达水平为DiFi细胞的(2.33±0.12)倍, 在Caco-2-R细胞中的表达水平为Caco-2细胞的(2.92±0.42)倍, 差异均有统计学意义(t=19.97、7.80, 均P<0.05)。双萤光素酶报告基因分析显示miR-140-3p模拟物与野生型circ0008274结合后的相对荧光强度低于结合前(0.28±0.04比1.00±0.00), 差异有统计学意义(t=-30.71, P=0.001)。DiFi-R、CaCo-2-R细胞中SMARCC1表达增强, 其蛋白质水平分别高于DiFi、Caco-2细胞(2.22±0.36比0.61±0.17、0.85±0.11比0.35±0.08), 差异均有统计学意义(t=6.23、6.32, 均P<0.01)。DiFi-R、Caco-2-R细胞敲除circ0008274后的细胞克隆形成数均低于敲除前(36.67±4.04比66.00±9.54、17.35±4.04比52.33±8.02), 10、50、100、150、200 nmol/L西妥昔单抗干预下, 相对活性细胞比均低于敲除前[DiFi-R细胞:(73.75±2.75)%比(88.10±2.48)%、(56.50±6.66)%比(75.15±6.03)%、(35.75±5.32)%比(59.63±6.67)%、(24.25±3.30)%比(52.40±6.71)%、(6.25±2.75)%比(48.60±5.38)%;Caco-2-R细胞:(63.74±5.25)%比(85.76±4.79)%、(56.50±4.20)%比(83.50±3.90)%、(46.00±2.94)%比(80.00±6.05)%、(35.30±5.56)%比(68.30±4.57)%、(12.25±7.37)%比(62.40±7.51)%], 差异均有统计学意义(t=4.90、6.71, -7.75、-4.16、-5.60、-7.53、-14.02, -6.19、-8.33、-10.10、-9.17、-9.56;均P<0.01)。10、50、100、150、200 nmol/L西妥昔单抗干预下, DiFi-R和Caco-2-R细胞转染miR-140-3p模拟物后的相对活性细胞比均低于转染空白对照微RNA后[DiFi-R细胞:(71.55±4.97)%比(85.90±2.66)%、(51.58±3.91)%比(74.95±6.35)%、(41.23±8.84)%比(58.43±7.05)%、(28.60±5.26)%比(53.75±5.65)%、(18.90±5.13)%比(51.30±3.30)%;Caco-2-R细胞:(61.75±2.22)%比(90.10±1.41)%、(53.25±4.17)%比(86.18±2.69)%、(46.38±4.55)%比(77.75±6.70)%、(36.10±8.76)%比(70.15±4.18)%、(24.25±2.63)%比(65.10±7.62)%], 差异均有统计学意义(t=-5.09、-6.47、-3.05、-6.28、-10.30, -21.48、-12.83、-8.01、-6.79、-10.12;均P<0.01)。敲除circ0008274后, Caco-2-R细胞通过pcDNA3.1 SMARCC1营救的SMARCC1蛋白质水平高于营救前(0.63±0.19比0.09±0.03), 10、50、100、150、200 nmol/L西妥昔单抗干预下的相对活性细胞比均高于营救前[(93.10±3.56)%比(83.83±3.97)%、(83.28±4.26)%比(60.90±7.02)%、(61.83±2.12)%比(50.10±5.59)%、(53.20±3.74)%比(40.50±3.42)%、(46.20±4.08)%比(30.80±4.82)%], 差异均有统计学意义(t=3.55、3.52、5.44、3.87、4.64、4.88, 均P<0.01)。耐药组患者结直肠癌组织中circ0008274和下游SMARCC1的相对表达水平均高于敏感组(6.45±1.32比2.26±1.39、12.53±1.60比3.82±1.56), miR-140-3p相对表达水平低于敏感组(3.91±1.25比7.43±2.23), 差异均有统计学意义(t=5.22、9.51、-2.93, 均P<0.01)。结论环状RNA circ0008274在结直肠癌组织、西妥昔单抗耐药结直肠癌细胞中呈高表达, 偶联并抑制miR-140-3p表达, 上调SMARCC1, 参与西妥昔单抗耐药的发生。pcDNA3.1 SMARCC1营救能够阻断si-circ0008274的西妥昔单抗增敏作用, 显著增加结直肠癌细胞的西妥昔单抗耐药性。
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单位武汉大学人民医院
