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摘要
目的:探讨柚皮苷通过环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)通路促进人脂肪间充质干细胞成骨分化的作用。方法:取人脂肪间充质干细胞培养传代，将细胞分为对照组、柚皮苷低、中、高剂量组、cAMP抑制剂(SQ22536)组、成骨分化诱导组(诱导组)，柚皮苷低、中、高剂量组分别加12.5μmoL/L、25μmo L/L、50μmoL/L柚皮苷，SQ22536组加100μmoL/L SQ22536，诱导组加10～8moL/L地塞米松、10mmoL/L β-甘油磷酸钠和50mg/L抗坏血酸;对照组仅加等体积培养液，每组设置6个复孔。培养48h后，碱性磷酸酶(ALP)染色，磷酸对硝基苯酯(PNPP)法检测各组细胞ALP活性;茜素红S(ARS)染色观察各组细胞钙沉积情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞cAMP水平;实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测各组细胞PKA、CREB、矮小相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素蛋白(OCN)、骨桥蛋白(OPN)信使核糖核酸(mRNA)表达;蛋白质免疫印迹法(WB)检测各组细胞PKA、CREB、RUNX2、OCN、OPN蛋白表达及p-PKA、p-CREB水平。结果:ALP染色后显示对照组细胞可见少量蓝色沉淀，SQ22536组蓝色沉淀最少，诱导组和柚皮苷3剂量组蓝色沉淀逐渐增多;与对照组比，SQ22536组ALP活性显著下降(P<0.01);与对照组和SQ22536组比，诱导组和柚皮苷3剂量组ALP活性显著上升(P<0.01);对照组存在少量钙沉积，SQ22536组细胞钙沉积显著减少，诱导组和柚皮苷3剂量组钙沉积逐渐增多;与对照组比，SQ22536组细胞cAMP水平、PKA、CREB、RUNX2、OCN、OPN mRNA和蛋白表达及p-PKA、p-CREB水平显著下降(P <0.01);与对照组和SQ22536组比，诱导组和柚皮苷3剂量组c AMP水平、PKA、CREB、RUNX2、OCN、OPN mRNA和蛋白表达及p-PKA、p-CREB水平上升，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);诱导组和柚皮苷低剂量组上述指标差异无统计学意义(P>0.05);上述指标柚皮苷呈剂量依赖性。结论:柚皮苷可促进人脂肪间充质干细胞成骨分化，可能与激活cAMP/PKA/CREB信号通路，促进RUNX2、OCN、OPN表达，上调ALP活性相关。
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