美洲鲎G因子α亚基的原核表达及临床深部真菌感染检测方法的构建

作者：吴智明; 陈少文; 周发友; 章宏祥; 唐晓磊^*

来源：中国病原生物学杂志, 2021, 16(01): 32-37.

DOI：10.13350/j.cjpb.210107

• 侵袭性真菌感染
• G因子α亚基
• 夹心法
• 诊断

目的验证美洲鲎来源的G因子α亚基(G Factorαsubunit, GFαSub)用于侵袭性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)检测的应用价值。方法原核表达并纯化美洲鲎G因子α亚基活性结合区域(葡聚糖天然配基),以该活性结构域包被96孔板作为捕捉元件,以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的G因子α亚基作为检测显色元件,正交法构建G因子α亚基夹心法,检测36例肺部IFI患者、52例肺部细菌感染患者和40例健康人血清中(1,3)-β-D-葡聚糖,评估夹心法的检测效能及其与G试验对阳性病例测得值的相关性进行分析。结果根据NCBI提供的数据库,合成pET30a-GFαSub252-668表达质粒,并通过IPTG诱导表达、Ni-NAT柱纯化GFαSub252-668蛋白,并使用商品化HRP标记试剂盒对其进行标记。通过正交法确定包被GFαSub252-668蛋白浓度和检测HRP标记的GFαSub252-668蛋白浓度分别为8 ng/ml和16 ng/ml。运用此夹心法检测128例临床血清标本(1,3)-β-D-葡聚糖含量,肺部IFI患者组(175.2±65.8)ng/ml,与细菌感染组(46.3±17.7)ng/ml和健康组(39.4±14.9)ng/ml差异有统计学意义(F=160.1,P<0.001);根据ROC曲线计算其灵敏度和特异度分别为91.67%(95%CI:77.53%-98.25%)和82.61%(95%CI:73.3%-89.72%);其与G试验36例IFI患者血清中检测(1,3)-β-D-葡聚糖水平具有良好相关性(R2=0.7592)。结论建立的双GFαSub252-668蛋白夹心法检测(1,3)-β-D-葡聚糖具有较高的灵敏度和特异度,有望成为一种新型的IFI检测手段。

• 单位
  皖南医学院第二附属医院; 海南医学院第二附属医院