骨密质碎片法分离培养小鼠间充质干细胞及其生物学特性鉴定

作者：乔淑凯; 任汉云; 石永进

来源：中国免疫学杂志, 2013, 29(01): 74-79.

• 间充质干细胞
• 骨密质
• 细胞培养
• 鉴定
• 多向分化

目的:建立一种从小鼠骨密质中分离培养间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的高效方法,并证实骨密质来源MSCs具有成骨、成脂肪和成软骨的多向分化能力。方法:采取骨片法从C57BL/6小鼠骨密质中分离和纯化MSCs,荧光倒置显微镜下直接观察不同生长时期MSCs形态学特征;流式细胞术(Flow cytometry,FCM)对其进行免疫表型鉴定;取第5代MSCs进行成骨、成脂肪和成软骨定向诱导并作组织化学染色鉴定,RT-PCR方法检测定向诱导后特异性基因表达:骨特异性的骨钙素(Osteocalcin,OCN)和骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)基因,脂肪特异性的脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LP)和脂肪酶(Adipsin)基因,软骨特异性的Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)和蛋白聚糖(Aggrecan)基因。结果:接种骨密质碎片约24小时后即可见短梭状细胞从骨碎片向周围爬出,呈贴壁生长,经3次传代后即可获得细胞形态均一、贴壁能力强、易于消化的梭形MSCs。第5代C57BL/6小鼠MSCs阳性表达CD44(99.81%)、CD29(99.77%)、Sca-1(99.76%)和CD34(94.51%),阴性表达CD45(0.86%)和CD117(0.17%)。第5代MSCs经诱导后可成功的分化为骨、脂肪和软骨细胞,相应茜素红、油红O和阿利辛蓝染色成阳性,并分别表达骨特异性骨钙素(Osteocalcin,OCN)和骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)基因,脂肪特异性脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LP)和脂肪酶(Adipsin)基因,软骨特异性Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)和蛋白聚糖(Aggrecan)基因。结论:经骨密质碎片法培养可以在较短时间内分离出更高纯度的MSCs,该方法操作简单、经济,稳定性好,分离效率高,可重复性强。培养出的MSCs符合公认的标准(具有塑料粘附、特定的免疫表型和多向分化潜能)。

• 单位
  北京大学第一医院