核转录因子E2F6通过β联蛋白信号通路调控恶性黑素瘤细胞增殖和转移的机制研究

作者：李晶; 罗茜; 罗焱; 刘素桃; 余音; 黎智; 刁庆春; 周宪; 隋江东; 王灿^*

来源：中华皮肤科杂志, 2020, 53(11): 905-913.

• 黑色素瘤
• E2F6转录因子
• β连环素
• 细胞增殖
• 细胞凋亡
• A375细胞

目的研究核转录因子E2F6在人恶性黑素瘤组织和细胞系中的表达, 及其对恶性黑素瘤细胞A375增殖、迁移和侵袭的影响。方法收集重庆市中医院2012年1月至2017年12月皮肤科确诊的50例皮肤恶性黑素瘤和30例色素痣冻存组织及石蜡切片。通过qRT-PCR分析E2F6 mRNA在人恶性黑素瘤和色素痣组织及7株恶性黑素瘤细胞系(HM、A375、WM451、WM35、SK-MEL-1、Hs-695T、MDA-MB-435s)和色素痣细胞中的表达, 免疫组化和Western印迹检测E2F6、β联蛋白在人恶性黑素瘤组织中的表达。采用脂质体转染法将E2F6抑制质粒和对照质粒转染至A375细胞, 通过qRT-PCR和Western印迹验证E2F6基因的敲减效率。通过CCK8、软琼脂平板克隆实验、Transwell迁移和侵袭实验、3D细胞培养实验检测E2F6基因敲减对A375细胞增殖、迁移和侵袭的影响, 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率, 通过Western印迹检测总β联蛋白、活化β联蛋白、c-Myc和细胞周期蛋白D1等水平。两组间比较采用t检验, 多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验;采用Pearson相关系数分析皮肤恶性黑素瘤中E2F6和β联蛋白表达的相关性。结果 7株恶性黑素瘤细胞系E2F6 mRNA相对表达水平均高于色素痣细胞(均P < 0.001)。qRT-PCR显示, 皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6 mRNA的相对表达(0.000 55 ± 0.000 17)高于色素痣组织(0.000 18 ± 0.000 09, t = 3.22, P < 0.001)。免疫组化、Western印迹显示, 皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6的相对表达水平高于色素痣组织(均P < 0.001), 而β联蛋白的相对表达水平低于色素痣组(均P < 0.001)。相关性分析显示, 恶性黑素瘤组织中E2F6蛋白与β联蛋白的表达呈负相关(免疫组化:r = -0.56, Western印迹:r = -0.63, 均P < 0.01)。敲减A375细胞E2F6基因后, E2F6抑制组E2F6 mRNA、蛋白相对水平低于对照组(t = 3.38、2.76, P < 0.001)。CCK-8实验显示, 继续培养后48 h, E2F6抑制组细胞增殖能力低于对照组(t = 4.58, P < 0.01);软琼脂平板实验显示, E2F6抑制组细胞相对克隆比低于对照组(t = 2.26, P<0.001);迁移实验显示, E2F6抑制组穿出小室细胞数(165 ± 23)低于对照组(376 ± 22, t = 3.14, P < 0.01);侵袭实验显示, E2F6抑制组穿出小室细胞数(96 ± 11)低于对照组(315 ± 31, t = 2.12, P < 0.01);3D细胞培养实验显示, E2F6抑制组细胞形态发生明显变化, 侵袭性伪足消失。流式细胞仪检测显示, E2F6抑制组G0-G1期细胞比例、细胞凋亡率均高于对照组(均P < 0.001)。Western印迹显示, E2F6抑制组β联蛋白水平、活化β联蛋白水平及其下游靶基因蛋白c-Myc、细胞周期蛋白D1水平均低于对照组(P < 0.001), P21蛋白水平高于对照组(P<0.001);E2F6抑制组上皮-间质转化相关分子波形蛋白、神经钙黏着蛋白水平低于对照组(P < 0.001), 而上皮钙黏着蛋白水平高于对照组(P < 0.001)。结论核转录因子E2F6在恶性黑素瘤中高表达, 敲减A375细胞E2F6基因可能通过拮抗β联蛋白信号抑制细胞增殖、迁移和侵袭。

• 单位
  重庆市中医院; 重庆市肿瘤研究所