细粒棘球蚴MAPKK样激酶及其下游成员ERK和P38酵母双杂交载体的构建与自激活鉴定

作者：张传山; 杨乐; 王丽敏; 李亮; 王俊华; 吕国栋; 林仁勇

来源：中国病原生物学杂志, 2014, 9(03): 207-215.

DOI：10.13350/j.cjpb.140304

• 细粒棘球绦虫
• MAPK
• 酵母双杂交
• 毒性
• 自激活

目的构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)丝裂原活化蛋白激酶激酶(EgMKK1)及其下游成员ERK、P38酵母双杂交载体,并检测融合蛋白对酵母菌生长的毒性作用及自激活活性。方法采集绵羊肝脏感染的Eg原头蚴,生理盐水冲洗5次,TRIzol法提取原头蚴总RNA,取1μg RNA反转录cDNA。以cDNA为模板,PCR分别扩增EgMKK1、EgERK和EgP38基因片段,分别经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,酶切片段连接至酵母双杂交载体pGADT7或pGBKT7,经酶切及测序鉴定正确后,应用PEG/LiAc法将重组载体转化入感受态酵母菌株Y2HGold,利用固体培养基筛选,检测融合蛋白对酵母菌株生长的毒性作用及自激活活性。结果经PCR扩增,分别获得目的基因EgMKK1、EgERK和EgP38。构建的重组酵母双杂交载体pGADT7-EgMKK1、pGBKT7-EgERK及pGBKT7-EgP38经双酶切,分别得到1 017bp、1 086bp和1 107bp目的基因片段,大小与预测值相符。重组酵母双杂交载体转化Y2HGold酵母菌在SD/-Trp平板上形成直径为1.52.0mm的菌落,与原始载体pGADT7或pGBKT7转化酵母菌菌落大小一致;重组酵母双杂交载体转化酵母菌在SD/-Trp和SD/-Leu平板均有直径约2mm白色菌落生长,而SDO/X/A和DDO/X/A固体培养基平板上无蓝色菌落生长。结论成功构建了酵母双杂交载体pGADT7-EgMKK1、pGBKT7-EgERK和pGBKT7-EgP38,其表达蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性和自激活作用,为进一步研究EgMKK1与其下游成员EgERK、EgP38之间的相互作用奠定了基础。

• 单位
  新疆医科大学第一附属医院