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摘要
环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclodextrin glycosyltransferase,简称CGTase或CGT酶, EC 2.4.1.19）属于α-淀粉酶家族,能够催化淀粉及相关基质进行分子间转糖基反应合成环糊精。环糊精是一种由不同葡萄糖单元组成的具有环状结构的低聚糖。环糊精作为分子胶囊,已被广泛应用于分析化学、农业、制药、食品及化妆品等领域。环糊精主要分成α、β、γ型。目前为止,见诸于报道的和商业化的绝大部分CGT酶是α和β-CGT酶。虽然γ-环糊精拥有比α、β-环糊精更大的非极性空腔和更高的水溶性,能够与活性大分子形成高活性浓度的包结配合物,但迄今为止,所知道的能够产γ-CGT酶的微生物还是不多,相关发酵产酶的系统研究报道也比较少。 本论文以实验室保藏的一株能高产γ-CGT酶的芽孢杆菌（B. macorous WSH 02-06）为生产菌株,以高的酶产量和高的酶生产强度为目标,系统研究了该菌株生产γ-CGT酶动力学特性。主要研究内容如下: 1.通过单因素扫描的摇瓶实验,确定了玉米淀粉是B. macorous WSH02-06生产γ-CGT酶的最佳碳源。产酶的最佳氮源是蛋白胨、玉米浆和硫酸铵。金属离子镁、锰、锌的组合添加在促进产酶和细胞生长方面的效果显著。正交优化实验结果表明,影响产酶的各种营养因素的主从因子顺序为玉米淀粉>硫酸锰>蛋白胨>硫酸锌。产酶的最适初始pH值为7.0,最佳的温度为37℃,合适的接种量为10 %,适合的摇瓶装液量为500 ml摇瓶装80 ml的培养基。发酵条件优化后得到的酶产量比优化前的酶产量提高了八倍左右,达到375.3 U·ml-1。摇瓶补料的实验结果表明,采用在发酵6小时补加氮源和发酵12小时补加碳源的这种补料方式有利于菌体生长和产酶。 2.在摇瓶发酵中,考察了镁、锰、锌等金属离子的不同组合添加对γ-CGT酶发酵的影响。研究结果表明,在发酵培养基中同时添加镁离子(4.88 mmol·L-1)、锰离子(2.96mmol·L-1)和锌离子(0.174 mmol·L-1)时,获得的γ-CGT酶产量最大,达392.5 U·ml-1,细胞干重也最大,为5.2 g·L-1,其中酶产量比不添加金属离子的对照组提高了三倍。这时获得的细胞量也为最大,达到5.2 g·L-1。 3.镁、锰、锌的添加促进了胞内能量物质ATP的合成。胞内的ATP/ADP由不添加金属离子进行发酵时的1.86,提高到镁、锰、锌组合添加进行发酵时的2.72,由此增加了细胞内的能量储备,有利于菌体生长和酶的合成。细胞量和酶产量的增加与镁离子的消耗量呈线性关系,但锰、锌离子的促进作用也不可忽视。
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