靶向小鼠Gaa基因的CRISPR/Cas9系统设计及打靶效力分析

作者：岳鹏鹏; 唐琴艳; 李欣怡; 陈玲; 付灿; 于鸿浩^*

来源：医学研究生学报, 2020, 33(10): 1021-1027.

DOI：10.16571/j.cnki.1008-8199.2020.10.003

• GAA基因
• 基因编辑
• CRISPR/Cas9系统
• 糖原贮积病

目的 GAA基因突变是人类II型糖原贮积病的遗传学病因,目前尚无根治方法。文章拟设计可模拟人类GAA基因强致病位点突变的靶向小鼠Gaa基因的CRISPR/Cas9系统,并在细胞水平验证其打靶效力。方法检索OMIM、ExAC以及ClinVar等数据库筛查人类Ⅱ型糖原累积病致病基因GAA的强致病位点。通过人和小鼠GAA蛋白序列比对分析将筛查到的强致病位点定位于小鼠基因组上。根据定位区域的小鼠基因组DNA序列,设计了3个向导RNA序列(Small Guide RNA,sgRNA)序列。然后构建了3个sgRNA表达载体,并将3个sgRNA表达载体分别与cas9表达质粒共转染小鼠N2a细胞。通过嘌呤霉素和杀稻瘟菌素进行药物筛选,收取阳性转染细胞。PCR扩增打靶区域DNA片段,利用T7EN I酶切反应和sanger测序初步分析打靶情况。随后通过高通量测序分析基因型和打靶效率。结果根据筛查结果判定人GAA蛋白的p.Tyr609位点为强致病位点,与小鼠Gaa蛋白的p.Tyr609位点相对应;根据小鼠Gaa蛋白p.Tyr609位点的DNA序列,成功构建了3个靶向该位点的sgRNA表达质粒;药筛阳性细胞打靶位点的PCR扩增产物测序及T7EN I酶切反应表明3个位点均发生了DNA变异;高通量测序结果表明3个位点的突变效率分别为49.45%、71.23%和70.91%。结论成功构建了靶向小鼠Gaa基因的高效CRISPR/Cas9系统,为深入研究Gaa基因的功能以及建立Gaa基因编辑小鼠模型进而探讨疾病的机制和治疗方法奠定基础。

• 单位
  桂林医学院