产气荚膜梭菌β1毒素蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

作者：张广林; 徐龙; 高云艳; 李玲霞; 刘永生; 尚佑军; 曹小安^*

来源：中国兽医科学, 2021, 51(10): 1207-1214.

DOI：10.16656/j.issn.1673-4696.2021.0156

• 产气荚膜梭菌
• β1毒素蛋白
• ELISA

为建立产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接ELISA检测方法,从C型产气荚膜梭菌扩增出编码β1毒素蛋白的基因,将其克隆至原核表达载体pET30a后,转入表达宿主菌BL21中,用IPTG诱导表达的包涵体蛋白经Ni柱纯化后,用不同浓度的尿素溶液进行复性处理。用不同浓度的重组蛋白包被酶标板,控制变量法对ELISA各步反应条件和血清、酶标二抗的稀释度进行优化。结果表明,纯化后的重组蛋白的纯度可达93%,且具有较好的反应原性,重组蛋白的最适包被浓度为1μg/m L、4℃过夜包被,山羊血清按照1∶300稀释,37℃反应15 min,家兔抗山羊酶标抗体按照1∶50 000稀释,37℃反应60 min时效果最好。对30份阴性血清的检测结果进行统计学分析,确定其临界判定值,即D450≥0.335 7为阳性,D450<0.335 7为阴性;并用相应的血清检验了该方法的敏感性、特异性和重复性。用此方法检测西北地区部分羊场的500份血清样品,其中有473份β1毒素抗体呈阳性,检出率为87.4%。此方法的建立为产气荚膜梭菌β1毒素抗体检测试剂盒的研发奠定了基础。

• 单位
  家畜疫病病原生物学国家重点实验室; 甘肃农业大学; 中国农业科学院兰州兽医研究所