Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的表达

作者：张静怡; 邓永宁; 张萌; 屈秋民^*

来源：新乡医学院学报, 2021, 38(01): 6-10.

• Sirt3基因
• 慢病毒
• 人神经母细胞瘤细胞
• 帕金森病

目的构建Sirt3基因过表达慢病毒载体,通过稳定感染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,建立Sirt3基因过表达的SH-SY5Y细胞株,为研究Sirt3在帕金森病细胞模型中的作用提供新的方法。方法从Gen Bank中检索Sirt3基因序列,根据此序列设计并合成人Sirt3基因引物,扩增Sirt3基因的c DNA片段,将其克隆至慢病毒载体Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin中,构建慢病毒表达质粒。采用聚合酶链反应方法对阳性克隆进行鉴定和测序分析。将重组过表达病毒质粒及其2种辅助包装原件载体质粒p Helper1.0、p Helper2.0共转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,测定病毒滴度。取对数生长期SH-SY5Y细胞,随机分为空白对照组、阴性对照组和Sirt3组,空白对照组SH-SY5Y细胞仅加入普通培养基,阴性对照组SH-SY5Y细胞转染阴性对照病毒,Sirt3组SH-SY5Y细胞转染Sirt3过表达慢病毒。转染后加入嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞。使用实时荧光定量聚合酶链式反应和Western blot检测各组细胞中Sirt3 mRNA和蛋白相对表达量。结果成功扩增Sirt3基因片段,大小1 242 bp;测序分析结果显示,过表达慢病毒Sirt3与Gen Bank中Sirt3基因序列完全一致,病毒滴度为1.2×1012TU·L-1。Sirt3组细胞中Sirt3mRNA和蛋白相对表达量显著高于空白对照组和阴性对照组(P <0.01);空白对照组与阴性对照组细胞中Sirt3mRNA和蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 Sirt3基因过表达慢病毒载体可成功构建,并获得稳定表达Sirt3基因的SH-SY5Y细胞株。

• 单位
  神经内科; 河南省人民医院; 西安交通大学; 郑州大学