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摘要
背景:mTOR复合物是调控胰岛β细胞质量与功能的关键蛋白,Deptor是复合物中的共有组分,Deptor的丢失是否会影响胰岛β细胞的胰岛素分泌功能,目前尚缺乏相关研究。目的:利用si RNA干扰技术沉默小鼠胰岛素瘤NIT-1细胞DEPTOR基因的表达,探讨其对胰岛素瘤细胞分泌功能的影响及背后的机制。方法:设计合成3对针对DEPTOR基因的si RNA序列,利用脂质体法将si RNA转染至NIT-1细胞。实验组设为6组:(1)空白转染组(NIT-1细胞,转染复合液仅加Lipofectamin);(2)阴性对照转染组(NC-FAM);(3)阳性对照转染组(GAPDH);(4)si RNA deptor 1组(脂质体介导的转染复合+si RNA deptor385);(5)si RNA deptor 2组(脂质体介导的转染复合+si RNA deptor766);(6)si RNA deptor 3组(脂质体介导的转染复合+si RNA deptor1275)。荧光显微镜下观察转染效率;QPCR检测DEPTOR m RNA的相对表达量;ELISA胰岛素试剂盒检测NIT-1细胞胰岛素分泌情况;Western blot检测DEPTOR下游关键蛋白的表达。结果与结论:(1)在荧光显微镜下观察,si RNA能有效转入到NIT-1细胞内,呈绿色点状荧光;(2)PCR检测干扰后DEPTOR m RNA的相对表达量,发现设计合成3对si RNA序列中有两对si RNA序列(si DEPTOR385and si DEPTOR766)对DEPTOR基因有干扰效果,干扰效果与阴性对照差异有显著性意义(P<0.05);(3)ELISA胰岛素测定结果显示,在NIT-1细胞中沉默DEPTOR后,有效转染组细胞的胰岛素分泌显著升高(P<0.05);(4)Western-blot检测结果显示,Deptor下游关键蛋白S6、4EBP-1磷酸化明显增加,AKT磷酸化略有减少;(5)结果说明,利用RNAi技术在NIT-1细胞上可以有效地沉默DEPTOR基因的表达,并促进细胞胰岛素的分泌,该现象可能与mTORC1通路的激活相关。
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