牛传染性鼻气管炎病毒内标荧光定量PCR检测方法的建立与应用

作者：季新成; 牛国辉; 员丽娟; 张彦明; 李鹏; 段晓东; 于学辉

来源：中国兽医学报, 2010, (06): 738-743+747.

• 牛传染性鼻气管炎病毒
• 荧光定量PCR
• 内标
• 共扩增 BHV1
• real-time PCR
• internal amplification control
• co-amplification

根据牛疱疹病毒1型(BHV1)gB基因序列,设计高度保守的引物和荧光探针,并扩增包含有荧光PCR扩增区域的核酸片段,通过凝胶纯化回收,将该片段克隆至pMD18-T载体,经鉴定后获得目标模板。通过碱基重排和引物设计,用搭桥法PCR扩增,获得BHV1荧光定量PCR内标模板。对内标模板的添加量和反应条件进行优化,建立了含有内标物的荧光定量PCR检测体系。该体系可以检测到10个拷贝/PCR反应的重组质粒,对BHV1可检测到0.01TCID50的病毒粒子,灵敏度比常规PCR和病毒分离高10～100倍,与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当。更重要的是,内标模板可以对反应体系进行监测,指示并校正假阴性结果,...

• 单位
  新疆出入境检验检疫局; 新疆大学; 西北农林科技大学