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摘要
本研究旨在克隆奶牛（Bos taurus）维甲酸相关孤儿受体α (RORα) 的蛋白编码序列 (coding sequence， CDS)，预测分析其结构与功能特征并验证其真核表达载体在HEK293T细胞中的过表达效果，进一步检测该基因在奶牛不同组织的表达谱。本研究提取了奶牛肝脏组织的总RNA，反转录得到cDNA，经过PCR扩增后获得奶牛RORα基因的CDS区片段，随后将其与pcDNA3.1-Puro-N-3HA线性化载体进行同源重组连接。转化感受态细胞DH5α后，将初步鉴定为阳性克隆的重组质粒进行测序。结合测序结果，利用ExPASy、Protscale和DNAstar等生物信息学软件，对奶牛RORα基因编码蛋白的理化性质和功能特性进行预测分析；之后将对照组空质粒pcDNA3.1-Puro-N-3HA和试验组重组质粒pcDNA-3.1-3HA-RORα分别转染至HEK293T细胞，借助实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR， RT-qPCR) 和蛋白质免疫印迹 (western blotting， WB) 技术检测奶牛RORα基因的过表达效果。最后，借助半定量RT-PCR (Semi-Quantitative RT-PCR) 技术检测奶牛RORα基因在肝脏、脾脏和肌肉等7个组织的相对表达量。结果显示，PCR成功克隆了奶牛RORα基因的CDS区片段，酶切及测序结果表明重组质粒pcDNA3.1-3HA-RORα构建成功；生物信息学软件预测分析结果表明，奶牛RORα蛋白三级结构与山羊（Capra hircus）、小鼠（Mus musculus）高度相似；不同物种间同源性对比显示，奶牛RORα基因与山羊和绵羊（Ovis aries）相似性极高。与对照组相比，试验组在HEK293T细胞中奶牛RORα基因在mRNA和蛋白表达水平均显著升高。半定量RT-PCR结果表明，在所检测的7个组织中，奶牛RORα基因在肝脏表达量最高，在脾脏表达量最低。本研究成功克隆了奶牛RORα的CDS区，在HEK293T细胞中验证了其真核表达载体在mRNA和蛋白水平的表达效果，并分析了其结构与功能特征，检测了其在不同组织的表达谱，为深入探究其在奶牛生殖与代谢调控中的作用机制提供前期基础。
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