中东呼吸综合征冠状病毒ORF5及其突变型基因真核表达载体的构建与表达

作者：张世豪; 黄姗; 陈嘉仪; 高静; 蔡金泰; 杨秀文; 赵卫; 张宝

来源：中国病原生物学杂志, 2021, 16(05): 507-512+519.

DOI：10.13350/j.cjpb.210503

• 中东呼吸综合征冠状病毒
• 附属蛋白
• 真核表达载体构建
• Western　blot

目的对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)ORF5及其突变型基因进行真核表达载体的构建与表达,为进一步研究ORF5作用机制奠定基础。方法将MERS-CoV野生ORF5基因序列(KT036372),截短ORF5(ORF5△)基因序列(KT036373)以及融合ORF5(ORF5+)基因序列(KT036374)克隆至真核表达载体质粒pEGFP-N1中,构建目的基因与EGFP融合表达质粒。采用定点突变技术在ORF5与EGFP之间添加终止密码或移码突变,并将ORF5、ORF5△、ORF5+蛋白126位、136位起始密码子突变为终止密码子。将测序正确的质粒转染HEK-293T细胞,Western blot检测相应蛋白的表达情况。结果成功构建ORF5、ORF5△、ORF5+真核表达载体。ORF5与EGFP融合蛋白在荧光显微镜下可见强荧光,但Western blot仅能检出EGFP蛋白,未能检出完整的融合蛋白;当ORF5与EGFP之间加入终止密码或移码突变后,仍能够检出EGFP蛋白。ORF5△、ORF5+与EGFP融合蛋白成功表达,以EGFP为抗原,ORF5△、ORF5+可检出多种不同分子质量蛋白,126位终止后仍可检出多种不同分子质量蛋白,136位终止后ORF5△缺少1种目的蛋白。结论成功构建MERS-CoV野生、截短以及融合ORF5的真核表达质粒。野生ORF5蛋白表达机制复杂,该蛋白可能存在类似内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)的特殊功能。变异体ORF5的表达存在多个翻译起始位点,其作用机制及功能需进一步研究。

• 单位
  公共卫生学院; 南方医科大学