应用四引物扩增阻滞突变体系PCR技术检测柔嫩艾美耳球虫二氢蝶酸合酶N377D突变

作者：耿天天; 王雅乐; 罗莉妍; 申邦; 方瑞; 胡敏; 赵俊龙; 周艳琴

来源：中国兽医学报, 2022, 1-5.

• 鸡球虫病
• 耐药性
• 四引物扩增阻滞突变体系PCR技术
• 单核苷酸多态性

面对严重鸡球虫病的磺胺耐药性,传统检测磺胺耐药的方法已无法满足临床应用,因此建立一种新的磺胺耐药柔嫩艾美耳球虫检测方法具有重要意义。本研究建立了一种使用四引物扩增阻滞突变体系PCR技术（amplification refractory mutation system-PCR,ARMS-PCR）用于准确区分柔嫩艾美耳球虫二氢蝶酸合酶（dihydropteroate synthase,DHPS）基因中的点突变（A1129G）的方法。对ARMS-PCR反应进行优化,最佳内外引物工作浓度比是5:1,Mg2+的最优工作浓度为10 mmol/L,dNTP的最优工作浓度为0.15 mmol/L,最佳Taq酶体积为0.1μL,最佳退火温度为62℃。本研究发现在合适的PCR体系下,能够检测出含有磺胺耐药柔嫩艾美耳球虫的最低检测限为40 fg,表明该方法灵敏度良好;通过在1对内引物（F-inner377s/R-inner377r）上倒数第3位碱基上分别引进错配,使该方法的特异性提高。因此,ARMS-PCR方法是一种简单快速的用以区分临床分离株单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）基因分型方法。

• 单位
  华中农业大学; 农业微生物学国家重点实验室