腺苷脱氨酶三种原核表达载体的构建及蛋白表达

作者：韩丽乔; 张露; 林海标; 黄小亭; 吴新忠; 黄**; 庄俊华^*

来源：国际检验医学杂志, 2019, 40(03): 281-289.

• 腺苷脱氨酶
• ADA
• 原核载体
• pET-28b
• pET-32a
• pHSIE
• 蛋白表达

目的利用分子克隆技术表达腺苷脱氨酶蛋白。方法从人白细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,再以其为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增腺苷脱氨酶基因,然后将目的基因连接到3种原核质粒pET-28b、pET-32a(+)和pHSIE中,再将测序完全正确的克隆质粒用CaCl2法转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达,并筛选最优表达条件,经Western-blot和SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。结果 3种质粒载体携带的目的基因DNA测序结果证实其很好地连接入载体质粒,表达的ADA蛋白经Western-blot和SDSPAGE鉴定符合,最优表达条件为诱导剂IPTG浓度0.4mmol/L,表达温度为16℃,表达时间为24h。结论该实验成功构建了腺苷脱氨酶的3个原核载体(BL21+pET-28b+ADA,BL21+pET-32a+ADA,BL21+pHSIE+ADA),且3个载体均成功高效表达了腺苷脱氨酶蛋白。

• 单位
  广州中医药大学第二附属医院