基于Qβ噬菌体的甲肝病毒装甲RNA标准参考样品的研制

作者：姚琳; 逄凤娇; 张奇; 庞倩倩; 李风铃; 江艳华^*; 王联珠; 翟毓秀

来源：微生物学通报, 2019, 46(01): 209-216.

DOI：10.13344/j.microbiol.china.180146

• 甲肝病毒
• Qβ噬菌体
• 装甲RNA
• 标准参考样品
• 实时荧光RT-PCR

【背景】目前食品中甲肝病毒分子的检测缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,影响了检测结果的科学性与准确性。【目的】基于Qβ噬菌体装甲RNA技术构建内含甲肝病毒检测靶标的装甲RNA (Hepatitis A virus armored RNA,AR-HAV),并开展初步定值、均匀性、稳定性研究,为HAV分子检测提供标准参考样品。【方法】人工合成包含Qβ噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、HAV检测靶标cDNA序列的核酸片段QGBHAV,并亚克隆到pET-28a(+)中构建重组质粒pET-QGBHAV,转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,利用超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析柱纯化AR-HAV后电镜观察。通过实时荧光RT-PCR对AR-HAV进行初步定值及均匀性和稳定性研究。【结果】SDS-PAGE结果表明重组质粒在大肠杆菌中有约14.1 kD的目的蛋白表达;纯化后的AR-HAV无杂蛋白和残留质粒;电镜下可见结构完整、大小约为25nm的病毒样颗粒;定值结果显示,AR-HAV中检测靶标RNA的含量为(2.57±0.12)×107 copies/μL;均匀性分析结果为F=1.23<F0.05 (9,20),证实AR-HAV的均匀性良好;稳定性结果表明,AR-HAV在可37°C保存9 d,25°C保存25 d,4°C保存40 d,-20°C保存180 d,-80°C至少保存360 d。【结论】基于Qβ噬菌体制备的AR-HAV拷贝数高,具有良好的均匀性和稳定性,可为HAV的分子检测提供安全、稳定的标准参考样品。

• 单位
  山东华宇工学院; 中国水产科学研究院黄海水产研究所; 农业部