活血荣络方调控生物钟蛋白Bmal1改善bEnd.3细胞糖氧剥夺/复氧损伤后血管新生的机制研究

作者：张宇星; 张瑛; 曾富康; 郭纯; 高晓峰; 李中; 陈瑶; 周德生^*; 刘利娟^*

来源：中草药, 2022, 53(20): 6509-6520.

• 活血荣络方
• 脑梗死
• 生物钟蛋白Bmal1
• 氧糖剥夺
• Bmal1敲降株
• 血管新生

目的 基于阴阳理论及活血荣络方（Huoxue Rongluo Recipe,HXRL）对脑梗死后血管新生的影响，探讨HXRL调控生物钟蛋白脑和肌肉芳烃受体核转位蛋白1(brain and muscle Arnt-like 1,Bmal1)促内皮细胞血管新生的作用机制。方法采用Western blotting检测小鼠脑微血管内皮细胞株（bEnd.3）受到糖氧剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）损伤后各时间点生物钟蛋白Bmal1和Clock的表达；利用染色质免疫共沉淀-测序分析（chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq）明确Bmal1在全基因组中发挥的作用，以及对bEnd.3细胞生物进程、细胞组成及分子功能的影响。采用CCK-8法检测HXRL含药血清最佳干预浓度，敲降bEnd.3细胞Bmal1基因，设置对照组、模型组、HXRL含药血清组、si-Bmal1组和si-Bmal1+HXRL含药血清组，通过划痕、迁移、成管等实验检测细胞迁移及血管形成能力；采用免疫荧光检测各组血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和神经源性基因Notch同源蛋白1(neurogenic locus notch homolog protein 1,Notch1)表达；采用Western blotting检测VEGF、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP2)、Notch1蛋白胞内结构域（notch1 intracellular domain,NICD）和δ样蛋白4(delta-like protein 4,DLL4)蛋白表达。结果 b End.3细胞受到OGD/R损伤后，Bmal1及Clock蛋白表达逐渐升高，造模8、12、16、20 h后具有显著差异（P<0.05、0.001）。ChIP-seq提示Bmal1在内皮细胞中参与细胞发育、分化、增殖等进程，靶向调节VEGF、Notch1启动子区域。CCK-8实验结果显示，bEnd.3细胞受到OGD/R损伤后，10%的HXRL含药血清可有效改善细胞活力（P<0.001）。划痕、迁移及成管实验证实HXRL含药血清可有效改善bEnd.3细胞OGD/R损伤后的迁移能力及血管生成能力（P<0.05、0.01、0.001），但在Bmal1敲降株中，该促进作用被抑制（P<0.05、0.01、0.001）。免疫荧光及Western blotting结果显示，HXRL含药血清可进一步升高OGD/R损伤的bEnd.3细胞中VEGF、MMP2、NICD、DLL4、Bmal1及Clock蛋白表达（P<0.05、0.01、0.001），在Bmal1敲降株中，HXRL含药血清对VEGF、MMP2、NICD及DLL4的促表达作用被抑制（P<0.05、0.01、0.001）。结论 HXRL可有效促进内皮细胞经OGD/R损伤后的血管生成能力，其作用机制与调控生物钟Bmal1蛋白密切相关。

• 单位
  湖南中医药大学; 湖南中医药大学第一附属医院