带Flag标签的Sirt2真核表达载体的构建及其与PKM2的相互作用

作者：朱祥; 李齐宏; 霍楠; 丛瑞; 马路园; 初众; 唐枝; 李春雨; 徐小洁^*; 闫志风^*

来源：军事医学, 2019, 43(07): 510-513.

• 人胚肾细胞
• 沉默信息调节因子2
• 丙酮酸激酶
• 免疫共沉淀
• 转染

目的构建带Flag标签pcDNA3.0载体的沉默信息调节因子2(Sirt2)真核表达载体,验证其表达蛋白与M2型丙酮酸激酶(PKM2)的相互结合。方法利用聚合酶链反应(PCR)从人乳腺文库中扩增出人Sirt2的CDS编码序列,将扩增出的Sirt2基因片段插入双酶切后pcDNA3.0-Flag载体上,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后提取质粒,验证表达,测序正确后,分别转染pcDNA3.0-Flag/myc-PKM2和Flag-Sirt2/myc-PKM2共转染至人胚肾细胞(293T),通过免疫共沉淀实验证明Sirt2蛋白表与PKM2蛋白有相互结合。结果重组质粒Flag-Sirt2的基因序列与目的序列完全一致,Western印迹检测蛋白表达成功;免疫共沉淀实验证实Sirt2蛋白与PKM2蛋白有相互结合。结论成功构建了Flag-Sirt2真核表达载体,证实Sirt2蛋白与PKM2蛋白有相互结合,为进一步研究Sirt2在糖酵解中发挥的功能提供了基础。

• 单位
  解放军总医院; 中国人民解放军第252医院