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摘要
【目的】植物中,SNP标记具有分布广泛、分辨率高、共显性和多态性高等特点,是遗传研究的常用分子标记。桃全基因组测序完成,获得了大量SNP位点。利用现有的SNP数据进行简单、快速的SNP基因分型是基因定位、品种鉴定和图谱构建等后续研究的基础。文章拟建立采用高分辨率熔解曲线进行不同类型SNP的基因分型方法,以获得与桃温度敏感半矮生型基因紧密连锁的分子标记。【方法】以普通生长型（ST）单株97-32-46为母本,温度敏感半矮生型单株03-94-2（Tssd）为父本进行人工杂交,利用其分离群体96个后代单株为研究材料。在定位目标基因的区间内开发连锁和不同类型的SNP标记的基础上,采用高分辨率熔解曲线进行SNP的基因分型并获得与目标性状紧密连锁的SNP标记。【结果】明确了DNA模板和Mg2+是影响基因分型的关键因子,并确立了反应体系最佳浓度区间。在15μL反应体系中模板DNA的量低于5.0 ng时或Mg2+浓度低于1.6μmol·L-1时则不能完成PCR扩增和基因分型;根据亲本基因型和表型一致的SNP位点设计引物,扩增片段长度在140 bp左右。高分辨率熔解曲线分析可对由单个核苷酸变异引起的4种不同类型的SNP（A/T、A/G、A/C和C/G）进行基因分型,并正确区分了温度敏感半矮生型和普通生长型,与进行Sanger测序鉴定的结果一致。采用96孔板对温度敏感半矮生型和普通生长型各48个分离后代单株进行了PCR扩增和基因分型,确定了遗传距离。分型结果表明高分辨率熔解曲线分析技术可以将96个样杂交后代单株分为温度敏感半矮生型和普通生长型2种,正确地区分了A/A基因型和A/T基因型。在96个样品中仅1个没有成功扩增,在温度敏感半矮生型和普通生长型中各存在1个重组单株。获得与温度敏感半矮生型基因紧密连锁的SNP标记,遗传距离为2.11 cM。【结论】建立了基于高分辨率熔解曲线分析的SNP基因分型。尽管高分辨率熔解曲线分析技术无法区分两种不同纯合类型的SNP变异,但仍不失为区分已知变异SNP的有效方法。在已经获得桃大量SNP的基础上,该体系可用于桃的基因定位、遗传多样性和品种鉴定等研究。
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单位中国农业科学院郑州果树研究所; 农业部
