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摘要
为建立一种能够实现病毒活体示踪的狂犬病病毒(RABV),以有效地研究RABV的侵染机制,本研究基于重组RABV rERA载体,利用反向遗传技术构建了包含rERA全长基因组cDNA及萤火虫荧光素酶(Luc)基因的重组质粒,并经Pme I酶切鉴定正确后,将该质粒与辅助质粒共转染鼠肾成纤维细胞(BSR),4 d后收集上清液,在BSR细胞盲传3代后收集上清液,经RT-PCR扩增结果显示,获得了Luc基因的目的条带;间接免疫荧光试验(IFA)鉴定结果显示,上清液接种的细胞出现绿色荧光;将上清液中的重组病毒纯化后电镜观察结果显示重组病毒与亲本病毒均呈弹头状,Western blot结果显示纯化后重组病毒感染BSR细胞后均能够表达RABV 5种结构蛋白,与亲本病毒蛋白表达情况一致,上述结果表明获得了与亲本病毒性状一致的重组病毒,命名为rERALuc。将重组病毒在BSR细胞中连续传15代,每代均经PT-PCR及测序鉴定,并经IFA测定每代重组病毒的病毒滴度,分析重组病毒增殖稳定性;测定各代次重组病毒感染BSR细胞48 h后的荧光素酶活性,分析其遗传稳定性。各代次重组病毒的RT-PCR及测序结果显示,Luc基因均未发生突变;IFA结果显示,F5代及以后代次的重组病毒与亲本病毒在体外的病毒滴度无显著差异并能稳定传至15代;荧光素酶活性测定结果显示,重组病毒荧光素酶活性随传代次数的增加逐渐升高且从第5代以后的重组病毒均能够稳定表达荧光素酶,而亲本病毒荧光素酶活性一直维持较低水平,表明重组病毒具有较强的增殖及遗传稳定性。将重组病毒与亲本病毒分别感染BSR细胞和小鼠神经瘤细胞(NA),感染后不同时间(24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h),分别经IFA测定两种病毒的病毒滴度,绘制生长曲线,并测定二者的荧光素酶活性。结果显示,重组病毒与亲本病毒在这两种细胞中的生长特性均无显著差异;且rERA-Luc的荧光素酶活性均随感染时间的延长而逐渐升高,且均在感染后96 h达到峰值,而rERA荧光素酶活性则均较低,表明Luc基因的插入不影响重组病毒的生长特性及嗜神经性。将重组病毒和亲本病毒均以104ffu/只的剂量分别经肌肉注射(i.m.)和颅内接种(i.c.)6周龄BALB/c SPF级小鼠,同时设置这两种途径接种的PBS对照组,分别记录小鼠的体质量(i.m.组)和观察小鼠的临床症状(i.c.组)。结果显示,重组病毒i.m.组小鼠与亲本病毒i.m.组小鼠的体质量变化一致,重组病毒i.c.组小鼠的临床症状以及生存率与亲本病毒i.c.组小鼠无显著差异,而对照组小鼠均无临床症状,结果表明Luc基因的插入不影响亲本病毒的致病力。本研究构建的重组病毒rERA-Luc为研究RABV的致病机制奠定了基础。
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单位动物科学学院; 兽医生物技术国家重点实验室; 内蒙古农业大学; 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所; 农业部
