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摘要
目的探讨肝癌干样细胞(LCSLC)中程序性死亡蛋白配体1(PD-L1)的表达及其对LCSLC肿瘤干细胞特性和肿瘤生物学功能的影响, 探索LCSLC中调控PD-L1表达变化的上游信号通路和PD-L1调控干细胞特性和肿瘤生物学功能的下游分子机制。方法采用无血清球培养法培养肝癌细胞HepG2, 获得LCSLC。采用流式细胞术检测LCSLC中CD133等干性标志物分子的表达, Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测其干性特征分子和PD-L1的表达, 细胞功能实验检测其肿瘤生物学功能, 确认所获得的LCSLC具备肿瘤干细胞特性。以细胞信号通路抑制剂处理LCSLC, 明确介导PD-L1表达变化的相关上游信号通路。利用小干扰RNA(siRNA)下调LCSLC中PD-L1的表达, 检测干性特征分子的表达变化、LCSLC体内外肿瘤生物学功能变化以及下游细胞信号通路的变化。结果与普通HepG2细胞比较, LCSLC中CD133的表达率升高[分别为(92.78±6.91)%和(1.40±1.77)%, P<0.001], 干性特征分子CD133、Nanog、Oct4A和Snai1的表达水平升高(均P<0.05), 第7天的成球细胞数增多[分别为(395.30±54.05)个和(124.70±19.30)个, P=0.001], 细胞迁移率升高[分别为(35.41±6.78)%和(10.89±4.34)%, P=0.006], 穿膜细胞数增多[分别为(75.77±10.85)个/视野和(20.00±7.94)个/视野, P=0.002], 克隆细胞数增多[分别为(120.00±29.51)个和(62.67±16.77)个, P=0.043], G0/G1期细胞数增多[分别为(54.89±3.27)个和(32.36±1.50)个, P<0.001]。小鼠成瘤实验显示, LCSLC组移植瘤的重量为(1.32±0.17)g, 体积为(1 779.0±200.2)mm3, 均高于HepG2细胞组[分别为(0.31±0.06)g和(645.6±154.9)mm3, 均P<0.001]。LCSLC中PD-L1蛋白表达水平为1.88±0.52, mRNA的表达水平为2.53±0.62, 均高于HepG2细胞(均P<0.05)。细胞信号通路相关蛋白磷酸化信号传导及转录活化因子3(p-STAT3)和p-Akt在LCSLC中的表达水平高于HepG2细胞(均P<0.05), 经抑制剂处理下调p-STAT3和p-Akt的表达后, PD-L1的表达亦随之下调(均P<0.05);相反, 磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)在LCSLC中的表达水平低于HepG2细胞(P<0.01), 经抑制剂处理下调其表达后, PD-L1的表达无明显变化(P>0.05)。siRNA敲低PD-L1的表达后, 与siRNA-NC组比较, siRNA-PD-L1组LCSLC中CD133、Nanog、Oct4A和Snai1的表达均降低(均P<0.05), 成球细胞数减少[分别为(45.33±12.01)个和(282.00±29.21)个, P<0.001], 细胞迁移率降低[分别为(20.86±2.74)%和(46.73±15.43)%, P=0.046], 穿膜细胞数减少[分别为(39.67±1.53)个/视野和(102.70±11.59)个/视野, P=0.001], 克隆细胞数下降[分别为(57.67±14.57)个和(120.70±15.04)个, P=0.007], G0/G1期细胞数减少[分别为(37.68±2.51)个和(57.27±0.92)个, P<0.001], S期细胞数增多[分别为(30.78±0.52)个和(15.52±0.83)个, P<0.001]。小鼠成瘤实验显示, shRNA-PD-L1组的肿瘤重量为(0.47±0.12)g, 体积为(761.3±221.4)mm3, 均低于shRNA-NC组[分别为(1.57±0.45)g和(1 829.0±218.3)mm3, 均P<0.001 ]。同时, siRNA-PD-L1组LCSLC中p-STAT3和p-Akt的表达水平降低(均P<0.05), 而p-ERK1/2和β-catenin的表达水平无明显变化(均P>0.05)。结论 CD133+ LCSLC中PD-L1高表达, 对于维持其干性特征、促进其肿瘤生物学功能具有重要意义。
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