苦豆子内生真菌诱导子促进宿主生物碱合成关键酶基因表达的荧光定量PCR检测

作者：孙牧笛; 张庆宸; 胡丽杰; 李文学; 闫思远; 吕苗苗; 顾沛雯^*

来源：中草药, 2018, 49(19): 4621-4627.

• 荧光定量PCR
• 苦豆子
• 内生真菌诱导子
• 赖氨酸脱羧酶基因
• 氧化苦参碱

目的建立荧光定量PCR(qRT-PCR)检测苦豆子内生真菌诱导子促进宿主生物碱合成关键酶—赖氨酸脱羧酶(LDC)基因的表达的方法。方法根据苦豆子LDC和Lectin基因序列设计目的基因引物QLDC-F/QLDC-R和内参基因引物Lectin-F/Lectin-R;以5倍梯度稀释的c DNA作为标准样品,建立目的基因QLDC-F/QLDC-R和内参基因Lectin-F/Lectin-R的标准曲线,优化qRT-PCR反应体系与反应条件,分析比较半定量PCR与qRT-PCR的灵敏度;在苦豆子内生真菌NDZKDF13诱导子不同诱导时间下,高效液相色谱(HPLC)测定宿主氧化苦参碱(oxymatrine,OMA)的含量,qRT-PCR检测LDC基因的表达量,分析在内生真菌诱导下LDC基因与OMA合成积累的关系。结果在qRT-PCR体系中c DNA质量浓度为200 ng/μL,退火温度为61℃时检测结果最好;构建的目的基因和内参基因标准曲线,其循环阈值与模板浓度均呈良好的线性关系,扩增效率都在99%以上,灵敏度是半定量PCR的25倍;在内生真菌NDZKDF13诱导子诱导作用下,宿主LDC基因的表达量在第6天达到峰值,为对照的25.58倍;OMA含量的增加滞后于LDC基因表达量的变化,在诱导子处理第9天达到最高峰。结论成功将qRT-PCR技术应用于苦豆子的功能基因研究。通过对各种条件的优化探索,建立了准确和简单易行的检测苦豆子的功能基因表达的平台。

• 单位
  宁夏农林科学院; 宁夏大学