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摘要
使用GAP启动子可以实现β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的组成型表达。为了提高β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的产量,本研究通过梯度抗生素浓度筛选法构建了携带多拷贝β-甘露聚糖酶的毕赤酵母菌株,并利用实时荧光定量PCR技术确定了各菌株的拷贝数。考察了不同基因拷贝数对β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中表达的影响,同时研究了不同拷贝数下,培养温度对β-甘露聚糖酶分泌表达的影响。研究获得了β-甘露聚糖酶基因拷贝数为1、3、4、5、7的毕赤酵母重组菌株,结果显示β-甘露聚糖酶的m RNA水平随着拷贝数的增加而升高,β-甘露聚糖酶产量随着拷贝数的增加而提高,其中拷贝数为4时产酶水平最高,是单拷贝菌株的4.04倍,当拷贝数大于4时,酶的产量不再随着拷贝数的增加而增加。培养温度实验结果显示,较低的温度对重组菌株生产β-甘露聚糖酶有促进作用,当温度降低至22°C时,携带4拷贝的重组菌株的酶活是30°C时的3.5倍。为了探索上述实验结果在工业发酵上的应用潜力,我们进行了5 L反应器水平的发酵实验,4拷贝菌株在发酵72 h后,酶活达到2124U/mL。
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