基于光谱法-图像灰度法高通量筛选高效固定CO₂的苯甲酸脱羧酶

作者：范雁; 杨淼; 薛松

来源：中国生物工程杂志, 2021, 41(11): 55-63.

DOI：10.13523/j.cb.2107034

• 光谱法-图像灰度法
• CO2固定
• 2
• 3-二羟基苯甲酸
• 高通量筛选
• 苯甲酸脱羧酶

目的:苯甲酸脱羧酶能够催化羧化反应固定CO2,为了获得高效的苯甲酸脱羧酶,需要利用高通量分子克隆与突变体筛选系统对产生的大量突变体进行筛选,因此建立、开发高效的筛选评价方法对于获得高羧化效率的突变体至关重要。方法:利用2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶催化邻苯二酚固定CO2的反应体系,建立了光谱法-图像灰度法高通量筛选和评价固定CO2的苯甲酸脱羧酶突变体。利用分光光度法在308 nm快速定量羧化产物2,3-二羟基苯甲酸。同时利用高效液相色谱（HPLC）法对分光光度法的测定结果进行了校正,确定了分光光度法估算的2,3-二羟基苯甲酸浓度与HPLC方法测定的准确浓度之间具有良好的线性关系（R2=0.996）。利用HPLC-分光光度法的相关性可以获得实际样品中准确的2,3-二羟基苯甲酸浓度。利用Image J软件获得蛋白质标准品和突变体的灰度均值,根据灰度法定量蛋白质标准品的标准曲线计算突变体的蛋白质表达量。利用单位酶量催化邻苯二酚获得2,3-二羟基苯甲酸的浓度比较突变体的催化活性。结果:纯酶和粗酶体系下HPLC法测定的2,3-二羟基苯甲酸浓度与分光光度法测定的吸光度值的关系分别为C1=0.500A1-0.010（R2=0.996）和C2=1.458A2+0.431 9 （R2=0.991）。从13个突变体中获得了两个正向突变体,羧化活性分别是WT的3.5倍和1.7倍。结论:基于光谱法-图像灰度法可以实现高通量筛选固定CO2的苯甲酸脱羧酶,该方法可用于具有相似功能的苯甲酸脱羧酶对其他取代基的酚类和水杨酸类似物的底物选择性筛选。

• 单位
  中国科学院大学; 生物工程学院; 中国科学院大连化学物理研究所; 大连理工大学