稳定表达未折叠蛋白反应荧光报告基因的SH-SY5Y细胞系建立

作者：孙建强; 朱伟; 陈昱; 姜树原; 刘晓蕾; 谢雅彬; 谢伟; 巴德仁贵; 邵国; 贾小娥^*; 马宁^*

来源：中国老年学杂志, 2023, 43(23): 5757-5763.

• 未折叠蛋白反应(UPR)
• 70 kD热休克蛋白4重组蛋白(HSPA4)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)
• SH-SY5Y细胞

目的 通过稳定表达70 kD热休克蛋白(HSP)4重组蛋白(HSPA4)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的SH-SY5Y细胞系，直观实时反映细胞内未折叠蛋白反应(UPR)的变化。方法 以SH-SY5Y细胞的cDNA为模板，克隆HSPA4,并连接EGFP。将HSPA4-EGFP连接入慢病毒载体中，慢病毒转染SH-SY5Y细胞。使用3μg/ml嘌呤霉素处理细胞1个月，筛选得到HSPA4-EGFP稳转系。通过实时荧光定量聚合酶链反应(QPCR)、Western印迹、共聚焦显微镜检测等方法，证实HSPA4-EGFP稳转系能有效且实时反映UPR的变化。结果 扩增到HSPA4-EGFP,并成功构建HSPA4-EGFP稳定表达的UPR报告系统。QPCR检测表明，构建的报告系统可以指示UPR。在激光共聚焦显微镜下，可以观察到细胞内绿色EGFP的点状分布，其能够反映UPR错误折叠蛋白的多少及分布，分别加入UPR激活剂、抑制剂后，细胞内绿色EGFP的点状分布明显增多和减少，差异有统计学意义(P<0.05)。Western印迹检测到细胞中HSPA4-EGFP融合蛋白表达条带。结论 成功构建HSPA4-EGFP稳转系，能够直观实时反映UPR变化，为深入研究UPR及其相关疾病(包括老年性疾病)提供工具。

• 单位
  包头医学院