抗甲型流感病毒短发夹状RNA分子的体外生物合成及功能鉴定

作者：郭述良; 罗永艾

来源：第三军医大学学报, 2009, 31(10): 955-958.

DOI：10.3321/j.issn:1000-5404.2009.10.022

• 流感病毒,甲型
• 短发夹状RNA分子
• RNA干扰

目的制备抗甲型流感病毒短发夹状RNA分子(short hairpin RNA,shRNA),并鉴定其功能。方法针对甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)核壳蛋白(nucleoprotein,NP)和酸性RNA多聚酶(acidic RNA polymerase,PA)编码mRNA高度保守区序列设计并制备编码shRNA的双链DNA转录模板,分别将其插入pGenSil-1质粒,构建NP-shRNA和PA-shRNA表达载体,测序正确后,采以T7转录试剂盒制备NP-shRNA和PA-shRNA。将所制备的2种shRNAs分别或联合转入人气道上皮细胞(human bronchial epithelium,HBE),然后感染IAV A/PR8株,通过测定HBE细胞病变效应(cyto-pathogenic effect,CPE)、培养上清液病毒滴度以及NP、PA mRNA与蛋白表达水平,评估所制备的shRNAs对IAV A/PR8在HBE细胞中复制的抑制效果。结果编码shRNA的2种双链DNA转录模板序列正确。通过体外转录技术制备的NP-shRNA、PA-shRNA每100μl含量分别为59.4、50.6nmol,纯度均在2.0以上,浓度和纯度均高。与未转染shRNA的对照组比较,NP-shRNA、PA-shRNA、NP-shRNA+PA-shRNA转染组细胞内NP mRNA分别减少41.7%、44.1%和68.5%,PAmRNA分别减少43.4%、60.9%和73.7%,NP蛋白表达分别降低92.3%、84.0%和91.7%,CPE显著减轻,培养上清液病毒滴度显著下降。结论成功构建了2种抗IAV短发夹RNA分子,所制备的NP-shRNA、PA-shRNA对IAV A/PR8株在HBE细胞中复制有显著的抑制效果。

• 单位
  重庆医科大学附属第一医院