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摘要
背景随着视网膜色素上皮(RPE)细胞视网膜下腔移植治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)研究的开展,需要优化无动物源性成分(xeno-free)培养体系快速定向诱导人胚胎干细胞(hESCs)向RPE细胞分化以满足日渐增长的科研及临床需要。目的建立xeno-free培养体系,优化快速诱导hESCs向RPE细胞分化的方法。方法将hESCs克隆团接种至Vitronectin XFTM,在培养液中加入50 ng/ml noggin、10 ng/mlDKK-1以及10 ng/ml胰岛素样生长因子-1(IGF-1)培养2 d,第24天将培养液中noggin质量浓度减至10 ng/ml,并加入5 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),第46天移除培养液中的noggin和bFGF,第814天培养液中加入1μmol/L CHIR99021。倒置显微镜下观察ESCs在分化为RPE细胞过程中的形态变化,免疫荧光染色检测细胞内特异性抗原的表达以对分化细胞进行鉴定,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测细胞分化过程中RPE细胞特异性蛋白mRNA的相对表达变化量。结果分化培养第14天,部分细胞呈多角形并呈现铺路石样排列,且细胞内可见色素颗粒;培养第35天,诱导分化的细胞内表达RPE细胞特异性抗原Mitf及RPE65;培养至第60天,细胞内富含黑色素颗粒且呈规则六边形。与诱导分化前比较,诱导分化第7天和第14天hES-RPE细胞中Mitf mRNA的表达量分别增加了(3.43±2.77)倍和(8.91±2.83)倍,而RPE65 mRNA的表达量分别增加了(14.60±3.94)倍和(87.16±9.32)倍,分化第7天和第14天细胞中的Mitf mRNA和RPE65mRNA的相对表达量均明显高于分化前,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论hESCs可在含尼克酰胺、DKK-1、noggin、IGF-1和CHIR99021的xeno-free优化培养体系中快速分化为RPE细胞。
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单位中山大学中山眼科中心; 眼科学国家重点实验室
