羊源多杀性巴氏杆菌重组酶聚合酶扩增诊断方法的建立

作者：刘昂; 程逸文; 安琪; 张振兴; 李彬; 陈杰; 陈巧玲; 杜丽; 满初日嘎; 王凤阳; 陈思^*

来源：中国畜牧兽医, 2021, 48(10): 3752-3760.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2021.10.027

• 多杀性巴氏杆菌
• KMT1基因
• RPA检测
• 荧光探针
• 分子诊断

为建立适用于羊源多杀性巴氏杆菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)诊断方法,本研究依据前期测序鉴定的羊源多杀性巴氏杆菌KMT1基因序列构建pET-28a(+)-KMT1质粒标准品。设计基于RPA技术的特异性引物及RPA荧光探针,建立实时荧光RPA方法的最适反应体系。采用10倍梯度连续稀释的质粒标准品检测该RPA方法的敏感性并绘制相关性曲线;以10种不同菌株的基因组DNA为模板验证方法的特异性;用感染多杀性巴氏杆菌的山羊及小鼠组织样品对方法的可靠性进行验证。结果显示,本试验建立的实时荧光RPA方法最适反应温度为39℃,最佳引物为KMT1-Fe1,灵敏度达100拷贝/μL,检测下限为10拷贝/μL。与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、绿脓杆菌、产酸克雷伯菌、布鲁氏菌S2株和鲍曼不动杆菌均无交叉反应。对13个组织样本进行检测,阳性率为76.9%,与实时荧光定量PCR检测结果的符合率达92.3%。综上所述,本研究建立的羊源多杀性巴氏杆菌实时荧光RPA方法具有特异性强、灵敏度高、可靠、快速便捷等特点,适用于多杀性巴氏杆菌的临床分子诊断。

• 单位
  动物科技学院; 海南大学