重组日本血吸虫虫卵核糖核酸酶SjCP1412体外抑制肝星状细胞LX-2活化作用的研究

作者：李其凤; 宋丽君; 杨莹莹; 董盼盼; 梅丛进; 李溢鑫; 张键锋; 熊春蓉; 余传信^*; 杨坤^*

来源：中国血吸虫病防治杂志, 2022, 34(06): 566-579.

DOI：10.16250/j.32.1374.2022163

• 日本血吸虫
• 核糖核酸酶
• SjCP1412
• 肝星状细胞
• Smad4信号通路

目的 观察重组日本血吸虫虫卵核糖核酸酶SjCP1412(r SjCP1412)对体外培养的人肝星状细胞LX-2增殖、细胞周期、凋亡及活化的作用，并探索其潜在机制。方法 在大肠埃希菌BL21中采用原核表达方式表达rSjCP1412蛋白，并通过Ni-NTA亲和层析法及尿素梯度复性透析制备高纯度可溶性rSjCP1412蛋白。使用12.5、25.0、50.0μg rSjCP1412蛋白分别于37℃酶解酵母RNA 2、3、4 h，酶解产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，观察rSjCP1412蛋白RNA酶活性。采用CCK-8法检测经不同浓度rSjCP1412蛋白刺激48 h后LX-2细胞增殖，采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染法检测经不同浓度rSjCP1412蛋白刺激48 h后LX-2细胞凋亡，采用DAPI染色法检测经不同浓度rSjCP1412蛋白刺激48 h后LX-2细胞周期中G0/G1、S、G2/M期细胞百分比，采用荧光实时定量PCR(qPCR)检测经不同浓度rSjCP1412蛋白刺激48 h后LX-2细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达水平；采用Western blotting法检测经rSjCP1412蛋白刺激LX-2细胞48 h后Ⅰ型胶原、α-SMA和Smad4/7蛋白表达水平，以明确LX-2细胞活化。以上实验均设可溶性虫卵抗原（SEA）阳性对照和正常组（不含rSjCP1412蛋白的PBS）。采用rSjCP1412蛋白单独刺激或与转化生长因子-β1(TGF-β1)共同刺激LX-2细胞48 h后，采用Western blotting检测LX-2细胞中Ⅰ型胶原、α-SMA和Smad4蛋白表达水平，分析r SjCP1412作用于LX-2细胞的信号通路。结果 成功表达并制备了高纯度可溶性的rSjCP1412蛋白，且rSjCP1412蛋白具有RNA酶活性。与正常组相比，12.5、25.0、50.0μg/mL r SjCP1412和SEA处理48 h后，LX-2细胞存活率均显著下降（F=22.417、20.448,P均<0.05）;12.5、25.0、50.0μg/mL r SjCP1412蛋白处理48 h后，LX-2细胞凋亡率显著增加（F=11.350,P <0.05）;12.5、25.0、50.0μg/mL rSjCP1412蛋白处理48 h后，可导致LX-2细胞G0/G1期阻滞（F=20.710,P <0.05）。12.5、25.0、50.0μg/mL rSjCP1412蛋白处理可导致LX-2细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA m RNA表达水平均显著下降（F=11.340、456.600、23.100,P均<0.05）。rSjCP1412与SEA均可导致LX-2细胞中Ⅰ型胶原、α-SMA和Smad4蛋白表达水平下调，活化水平下降（F=1 302.000、49.750、52.420,P均<0.05）。此外，rSjCP1412蛋白抑制TGF-β1激活的LX-2细胞中Ⅰ型胶原、α-SMA和Smad4蛋白表达水平（F=66.290、31.300、27.010,P均<0.05)。结论 SjCP1412在体外能诱导肝星状细胞LX-2凋亡，对LX-2细胞增殖、细胞周期及活化均具有一定抑制作用，其作用机制与下调Smad4信号分子表达水平相关。

• 单位
  江苏省血吸虫病防治研究所