CRISPR/Cas9介导的同源重组在非编码区疾病相关位点功能研究中的应用

作者：徐宁; 周甜; 侯国俊; 沈南; 唐元家^*

来源：上海交通大学学报 (医学版), 2021, 41(01): 8-15.

DOI：10.3969/j.issn.1674-8115.2021.01.002

• 规律成簇间隔短回文重复序列
• 同源重组
• 全基因组关联研究
• 单核苷酸多态性

目的·以全基因组关联研究报道的系统性红斑狼疮相关单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs1978421为例,利用规律成簇间隔短回文重复序列/相关蛋白9 [clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR associated protein 9,CRISPR/Cas9]系统建立非编码区疾病相关的遗传突变位点功能的研究策略。方法·针对SNP rs1978421位点设计单链导向RNA (single guide RNA,sgRNA),利用T7核酸内切酶Ⅰ(T7 endonucleaseⅠ,T7EⅠ)实验在HEK293T细胞中验证sgRNA对靶点的切割效率。以电穿孔转染的方式将融合Cas9-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和sgRNA的表达质粒及同源重组的模板转染至U-937细胞内,通过流式分选得到单个的GFP阳性U-937细胞,培养14 d后进行基因型鉴定。筛选得到同源重组的细胞克隆后,通过实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)对rs1978421上下游2 Mbp范围内的基因及miR-146a进行定量,分析rs1978421不同等位基因对miR-146a及其周围基因的表达影响。结果·T7EⅠ实验表明,约有24%的HEK293T细胞中的rs1978421位点发生切割。在U-937细胞内进行的同源重组实验中,共计得到141个细胞株;其中6个同源重组成功,成功率为4.3%。qPCR结果显示,在野生型TT与同源重组成功CC的U-937细胞中,miR-146a及所检测基因的表达情况均无显著变化(均P>0.05)。结论·SNP rs1978421对其周围2 Mb范围内的基因及miR-146a并无调控作用,但该研究证明了CRISPR介导的同源重组技术用于非编码区SNP位点功能研究的可行性。

• 单位
  上海交通大学医学院附属仁济医院