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摘要
目的通过了解外界刺激因子β萘黄酮(β-NF)对大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因转录的影响,研究大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因转录的调节机制。方法利用大鼠GCLC基因调控序列驱动的GCLC-PGL3-enhancer-Luciferase报道载体(GCLC-Luc)转染大鼠支气管上皮细胞(RTE)和肝癌细胞(H4ⅡE),分DMSO空白对照组和不同浓度的各刺激因子组,比较各组荧光素酶值的差异以筛选影响GCLC基因转录调控的刺激因子,并比较筛选到的刺激因子β-NF对GCLC-Luc在RTE和H4ⅡE细胞内表达影响的异同。2种转染后的细胞均分为β-NF实验组(10μmol/L)和DMSO空白对照组,以荧光定量PCR检测各组的细胞内源性γ-GCS转录水平变化。分别将构建的r系列缺失报道载体、GCLC-Luc和激活蛋白1(AP-1)、NF-κB定点突变报道载体转染2种细胞,分β-NF实验组(10κmol/L)与DMSO空白对照组,比较各组荧光素酶值的变化,分析β-NF作用的调节位点和转录调控作用相关元件。结果 1、10、100μmol/L的β-NF均强烈抑制RTE中GCLC基因表达,荧光素酶值显著低于DMSO空白对照组(16135±1456、2752±218、1579±294比25971±1662,均P<0.01)。在H4ⅡE中,1、10、100μmol/L的β-NF则促进其表达,荧光素酶值显著高于DMSO空白对照组(5686±441、13601±746、13978±164比3645±367,均P<0.01)。荧光定量PCR显示10μmol/L的β-NF作用下,RTE内源性γ-GCS的mRNA表达水平是DMSO空白对照组的0.73倍,在H4ⅡE细胞中则是1.98倍。GCLC-Luc、r系列缺失报道载体转染2种细胞后,RTE中各载体β-NF实验组荧光素酶值均低于DMSO空白对照组(P<0.01),而H4ⅡE中则高于DMSO空白对照组(P<0.05)。β-NF作用的调节位点定位于转录起始位点上游-390～+2bp范围内。用针对该区域的AP-1、NF-κB定点突变报道载体转染细胞后,转染GCLC-Luc载体的β-NF实验组RTE荧光素酶值较DMSO空白对照组下降(91.50±0.32)%,与之相比,转染AP-1、NF-κB定点突变报道载体的细胞下降幅度并没有减少(P>0.05)。在H4ⅡE,β-NF作用下转染GCLC-Luc载体的细胞荧光素酶值上升幅度则高于转染AP-1定点突变报道载体的细胞[(3.81±0.19)倍比(2.08±0.19)倍,P<0.05],而与转染NF-κB定点突变报道载体的细胞荧光素酶值上升幅度[(4.41±1.01)倍]相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论在大鼠RTE和H4ⅡE,β-NF影响GCLC基因的表达具有细胞特异性。在大鼠H4ⅡE,β-NF通过激活抗氧化应答元件(ARE)类似的AP-1调控GCLC基因表达。
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单位广州医学院; 广州医学院第一附属医院广州呼吸疾病研究所; 呼吸疾病国家重点实验室
