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摘要
目的克隆天麻糖基转移酶基因(glycosyltransferase,Ge GT1)的全长cDNA序列,进行序列分析和原核表达分析,并探究该基因在天麻不同器官中的表达规律。方法在天麻转录组数据库中通过注释和比对,用PrimerPremier5.0软件设计基因特异性引物。通过反转录聚合酶链式扩增(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法从天麻块茎中克隆得到Ge GT1全长cDNA序列,利用生物信息学软件预测基因编码蛋白的特征;利用Clustal W和MEGA6.06软件构建GeGT1的系统进化树;构建原核表达载体pET-28a-GeGT1,转化至大肠杆菌Transetta(DE3)进行诱导表达;通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)技术分析基因表达模式。结果 Ge GT1基因开放阅读框(open reading frame,ORF)全长1503 bp,编码500个氨基酸,蛋白相对分子质量为55 494.33,理论等电点为5.51,为稳定的酸性蛋白。襄襆襈襌襐襒襔襠襢襦襨襶襼覊覌覚覜覦覨覮覰覸覺覼覾览觊角觔觜膜结构域,无信号肽,为非分泌蛋白。通过序列同源性分析,GeGT1与铁皮石斛具有较高的同源性。系统进化树分析证实了兰科植物糖基转移酶基因的同源性。SDS-PAGE结果显示,诱导表达蛋白为63 000,与预期蛋白大小一致。基因表达结果显示,Ge GT1基因的表达水平在花中最高,其次是块茎、茎。结论首次克隆并分析了Ge GT1基因,建立了原核表达体系,为进一步研究天麻活性成分合成的分子机制奠定基础。
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