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摘要
中国小麦花叶病是引起小麦(Triticum aestivum)严重减产的中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)造成的。本研究旨在以制备的抗CWMV特异性单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)为核心建立检测CWMV的血清学方法,为该病毒病的诊断和科学防控提供技术支撑。用CWMV提纯病毒免疫小鼠(Mus musculus),经细胞融合、培养基筛选培养、阳性细胞的检测与单克隆化后,共获得4株能分泌抗CWMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株5H5、7C2、9A7和12E5,并注射入BALB/c小鼠(Mus musculus)腹腔制备单抗腹水;间接酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)表明,4种单抗腹水效价均达到10-7,抗体类型及亚类均为Ig G1、kappa链。Western blot分析表明,4株单克隆抗体均能与CWMV的外壳蛋白亚基有特异性反应。利用制备的单抗建立检测田间小麦样品中CWMV的抗原包被酶联免疫吸附实验(antigen coating plate enzyme-linked immunosorbent assay,ACP-ELISA)和斑点酶联免疫吸附实验(dot-enzyme-linked immunosorbent assay,dot-ELISA),结果表明,该两种血清学方法检测感染CWMV小麦植物组织粗提液呈特异性阳性反应,而检测感染小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的小麦、感染大麦黄花叶病毒(Barley yellow mosaic virus,Ba YMV)的大麦(Hordeum vulgare)和健康小麦均呈阴性反应,说明建立的两种方法能特异性地检测小麦植物中的CWMV。灵敏度分析表明,以5H5和12E5单抗为核心建立的ACP-ELISA方法检测小麦病叶的灵敏度达到1∶81 920(W/V,g/m L),而以7C2和9A7单抗为核心建立的ACP-ELISA方法检测小麦病叶灵敏度达到1∶40 960(W/V,g/m L)倍稀释;以12E5和5H5单抗为核心建立的dot-ELISA方法检测小麦病叶的灵敏度达到1∶2 560倍稀释(W/V,g/m L),而以7C2和9A7单抗为核心建立的dot-ELISA方法的检测灵敏度达到1∶1 280倍稀释(W/V,g/m L)。田间样品检测结果表明,建立的ACP-ELISA、dot-ELISA方法能准确、可靠地用于小麦中CWMV病毒的检测,且进一步证明该病毒病在江苏和山东流行。CWMV单克隆抗体的制备及其血清学检测方法的建立为中国小麦CWMV的诊断、预测预报及科学防控提供了物质和技术支撑。
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