双酶切法构建CRISPR-Cas9载体系统的研究

作者：杨勇; 乔霞; 刘晓明; 魏军

来源：中国病原生物学杂志, 2018, 13(09): 949-952+957.

DOI：10.13350/j.cjpb.180905

• 基因编辑技术
• crispr-cas9
• 载体构建
• 限制性内切酶

目的以pet41a质粒为载体骨架,通过酶切连接法构建crispr-cas9载体系统,建立一种简单有效的基因编辑载体,为研究细菌耐药基因的敲除提供方法。方法选择质粒pet41a、pwt-cas9和pgRNA,分析核酸序列,选择合适酶切位点。使用XhoI和BgiII两种限制性内切酶分别酶切pet41a和pwt-cas9,形成带有相同粘性末端的线性载体片段,回收并用T4DNA连接酶连接,连接产物转化DH5α感受态细胞,转化菌涂布含卡那霉素的固体LB培养基平板进行阳性单克隆筛选并测序,构建的质粒命名为pet41-cas9。使用BgiII和XbaI两种限制性内切酶分别酶切pet41-cas9和pgRNA,经回收纯化、连接和转化后筛选阳性单克隆菌落并测序,重组质粒命名为pet41a-cas9-gRNA。分别将重组质粒pet41-cas9和pet41a-cas9-gRNA转化BL-21(DE3),IPTG诱导后提取蛋白进行SDS-PAGE分析。结果测序证实质粒pet41-cas9、pet41a-cas9-gRNA连接正确,载体构建成功。重组质粒粒转染DE3后经IPTG诱导4h,表达相对分子质量为160×103的重组蛋白,与cas9蛋白理论分子质量相符。结论成功构建CRISPR-Cas9载体系统质粒pet41acas9-gRNA并表达重组cas9蛋白,为细菌基因的编辑研究奠定了实验基础。

• 单位
  宁夏临床病原微生物重点实验室; 宁夏医科大学; 宁夏医科大学总医院