携带IP-10基因双歧杆菌载体的构建及鉴定

作者：梅毅; 张定国; 王立生; 朱忠生

来源：广东医学, 2013, 34(15): 2288-2292.

DOI：10.3969/j.issn.1001-9448.2013.15.004

• 长双歧杆菌
• 绿色荧光蛋白基因
• γ干扰素诱导蛋白10

目的 构建并鉴定携带人γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)基因的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭分泌型表达载体,探索抗肿瘤基因治疗的新型载体.方法 用改良型MRS双歧杆菌选择培养基,从人新鲜粪便分离长双歧杆菌,通过PCR方法克隆双歧杆菌的内源性阿拉伯糖苷酶的启动子和分泌性信号肽DNA序列(ara).然后以大肠杆菌质粒pBAD-A和pBS-T为基础,以ara启动子取代原有的启动子,以绿色荧光蛋白基因(GFP)作为报告基因,构建大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒pBS-BPP-ara-GFP.通过PCR方法扩增真核表达载体pBLAST49-hIP-10质粒中的IP-10基因,将其克隆到穿梭质粒pBS-BPP-ara-GFP中,采用电转化法将正确克隆的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒导入双歧杆菌中,并以L-arabinose诱导表达.在激光共聚焦显微镜下观察转基因双歧杆菌中GFP蛋白的表达;运用免疫蛋白质印迹(Western blot)检测转基因双歧杆菌中IP-10的蛋白表达水平.结果 含GFP基因的转基因双歧杆菌在激光共聚焦显微镜下观察到绿色荧光.含IP-10基因的转基因双歧杆菌经Western blot检测到分子量为8.47 kD的目的 蛋白条带.结论 成功构建能表达IP-10蛋白的穿梭质粒载体pBS-BPP-ara-GFP-IP-10,为IP-10转基因双歧杆菌的抗肿瘤机制及其抑瘤效应的研究奠定基础.

• 单位
  广东省深圳市人民医院; 第二临床医学院; 广东省深圳市儿童医院; 暨南大学