重叠延伸PCR-酶切连接法构建链霉菌表达载体

作者：田平雅; 吕苗苗; 杨光耀; 马次郎; 牛春; 张萍

来源：黑龙江农业科学, 2021, (01): 5-10.

• 重叠延伸PCR
• pSET152载体
• 酶切
• 连接

在功能基因组学时代,对基因的功能研究将涉及到大量的载体构建,为建立一种链霉菌外源基因多拷贝表达的载体构建方法,本研究采用重叠延伸PCR与双酶切结合的连接方法,构建链霉菌表达载体,以红霉素工业生产菌红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)基因组DNA为模板,扩增红霉素合成相关的甲基化酶基因(erythromycin O-methyltransferase,eryG)和羟基化酶基因(erythromycin C-12hydroxylase,eryK),以及启动子permE基因,采用重叠延伸PCR及EcoRⅤ、NotⅠ和XbaⅠ酶切位点相结合的连接方法构建含有多个基因片段的链霉菌重组表达载体。成功构建了携带外源基因的表达载体pSET001、pSET002和pSET003,最终获得含有多个基因的重组质粒。双酶切载体构建时载体或DNA片段上可用的限制性酶切位点受到限制,通过结合重叠延伸PCR技术,可以利用较少的内切酶快速构建含有多个基因片段的重组载体,为红霉素生产菌的改造提供了重组载体。