利用CASAAV技术诱导心肌特异性Meis1敲除实现心肌原位增殖

作者：颜耀彬; 张兴中^*

来源：中国分子心脏病学杂志, 2023, 23(03): 5441-5449.

DOI：10.16563/j.cnki.1671-6272.2023.06.015

• CASAAV
• CRISPR/Cas9
• Meis1
• 腺相关病毒
• 心肌增殖
• 心脏再生

目的 探讨基于CRISPR/Cas9/AAV的体细胞突变（CRISPR/Cas9/AAV-based somatic mutagenesis, CASAAV）技术诱导心肌细胞Meis1基因的特异性敲除实现小鼠心肌细胞原位增殖的可行性。方法 设计两条靶向小鼠Meis1基因的sg RNA序列逐个克隆至p AAV-U6g RNA1-U6g RNA2-Tn T-Cre载体中，并包装成腺相关病毒。分离RosaCas9EGFP/Cas9EGFP基因敲入小鼠的乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞进行病毒的体外感染，利用细胞免疫荧光染色检测病毒的心肌特异性。给予RosaCas9EGFP/Cas9EGFP基因敲入小鼠的乳鼠胸腔内注射病毒进行体内感染，3周后利用心脏灌流技术分离心肌细胞，利用细胞免疫荧光染色检测病毒的心肌特异性和心肌细胞的增殖水平，利用一代测序技术和实时PCR技术分别检测心肌细胞中Meis1基因的编辑水平及Meis1基因和细胞周期相关基因的mRNA相对表达量；同时制作心脏组织切片并利用组织免疫荧光染色检测心脏组织中增殖标志物KI67、PH3及AURKB的蛋白表达水平。结果 腺相关病毒可特异性诱导心肌细胞中EGFP和Cas9的表达。体内感染腺相关病毒后，心肌细胞中的Meis1基因编辑效率达到56.67%±4.16%,Meis1基因的mRNA相对表达量显著下调（P<0.05），而细胞周期相关基因的mRNA相对表达量均显著上调（P<0.05），同时EGFP+KI67+的心肌细胞比例显著上调（P<0.05）；心脏组织中增殖标志物KI67、PH3及AURKB的蛋白表达水平均显著上调（P<0.05）。结论 利用CASAAV技术可实现小鼠心肌细胞Meis1基因的特异性敲除，促进小鼠心肌细胞的原位增殖，明确了CASAAV技术在快速构建体细胞基因敲除模型中的可行性以及在心脏再生领域中的临床转化潜能。

• 单位
  北京协和医学院; 中国医学科学院阜外医院; 国家心血管病中心