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摘要
本研究旨在建立牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)实时荧光定量PCR(RT-qPCR)快速检测方法。通过查阅中外相关文献,设计并筛选出一对引物用于特异性扩增BRSV核衣壳(N)蛋白基因片段。对该目的基因进行克隆和测序后通过体外转录技术制备cRNA,计算体系中RNA的浓度;分装后验证其重复性与稳定性,并借助数字PCR进行联合定值确定参考品的最终浓度;使用该BRSV参考品作为模板,设计引物和探针,通过反应条件的优化,建立了BRSV RT-qPCR快速检测方法,并对其灵敏度、特异性、稳定性和准确性进行评价。结果表明,制备的BRSV参考品定值结果为(1.11±0.04)×1011 拷贝数/mL。所建立的RT-qPCR快速检测方法能有效鉴定BRSV核酸参考品,最低可检出病毒核酸104拷贝数/mL;与另外8种反刍动物病原均无非特异性扩增,特异性强;对临床样本检测的结果与测序结果一致性达100%。结果显示,本研究建立的BRSV RT-qPCR快速检测方法特异性强、灵敏度高,具有较大的临床应用价值。
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