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摘要
垂体腺苷酸环化酶激活肽（pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，PACAP）是具有重要生物学功能和极具应用价值的神经多肽。为利用基因工程技术获得非融合的重组人垂体腺苷酸环化酶激活肽（recombinant human PACAP，rhPACAP），采用rhPACAP与纤维素结合域（cellulose binding domain，CBD）融合表达，并在两者之间引入Xa因子的识别位点（Ile-Glu-Gly-Arg↓）。融合蛋白CBD-PACAP经纤维素亲和层析纯化后，Xa因子酶切释放非融合重组PACAP。HPLC进一步纯化的重组PACAP多肽经Western blot与激光飞行质谱鉴定。制备的rhPACAP具有促进胰腺癌细胞株SW1990胞内cAMP合成的活性，表明其具有生物学活性。 在两个融合蛋白（CBD-PACAP和CBD-IGF）中Xa因子识别位点（Ile-Glu-Gly-Arg↓）前引入7个氨基酸组成的富含甘氨酸柔性短肽（Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly），经比较Xa因子对引入短肽前、后融合蛋白的酶切效率后发现，短肽的引入不同程度地提高了融合蛋白CBD-IGF和CBD-PACAP对Xa因子的敏感性，此研究结果提供了一种提高Xa因子酶切效率的策略。 为利用蛋白内含肽介导的一步纯化实现重组PACAP（RMPACAP）的高效制备，将目的多肽融合表达在具可诱导剪切功能的亲和纯化标签的N端，实现融合蛋白RMPACAP-intein-CBD的高效表达；融合蛋白经几丁质柱纯化后，硫醇诱导蛋白内含肽自动切割释放目的多肽RMPACAP；所制备的RMPACAP与天然PACAP38相比，在其N端多了一个甲硫氨酸（Met），但其促进SW1990细胞胞内cAMP生成的活性与PACAP38标准品相同。利用此工艺，1L的菌体培养物可获得22mg的纯度可高达98％的RMPACAP多肽。此研究建立了一种高效制备重组PACAP的方法。 模仿已有的VPAC2受体特异激动剂序列，结合已建立的蛋白内含肽介导的多肽制备工艺，设计并实现4条重组多肽（RMROM、RROM、RMBAY和RBAY）的制备；四条重组多肽（50ng／kg）与高浓度葡萄糖（1.8mmol／kg）共同腹腔注射NIH小鼠时，均有效协助降低血糖；其中RMBAY的降糖作用较其它重组多肽显著，并可有效促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌。RMBAY的筛选及其制备方法的建立为开展重组多肽RMBAY治疗Ⅱ型糖尿病的研究奠定基础。 为从分子和细胞水平研究所制备的重组多肽RMPACAP及RMBAY对PACAP的三个受体的选择性（Selectivity）和激动性（Potency），从分子水平诠释重组多肽的作用机制，构建分别高效表达PACAP三个受体：PAC1、VAPC1和VPAC2的中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞株。RT-PCR鉴定受体基因在mRNA水平的表达；Western blot和荧光免疫法鉴定VPAC1和VPAC2受体的表达。125I-PACAP38配体与受体结合实验检测PAC1受体的表达。重组多肽与125I-PACAP38对受体的竞争结合实验结果显示RMPACAP对三个受体均具有选择性；而RMBAY对VPAC2受体的IC50为70±5nmol／L，对VAPC1受体和PAC1受体的IC50均大于10μmol／L。重组多肽RMBAY促进VPAC2-CHO细胞株胞内cAMP产生的EC50为1.8±0.2nM，RMPACAP的EC50为5.3±0.3nM。RMBAY对VPAC2受体具有特异的选择性和激动性，是VPAC2受体的特异激动剂。RMBAY的筛选和鉴定为具有自主知识产权的VPAC2受体特异激动剂的研究和开发铺垫道路。 为提高多肽的活性和稳定性，尝试利用蛋白内含肽可诱导剪切功能和多肽硫酯环合技术实现RCBAY环肽的制备。激光飞行质谱检测制备产物中含有成分的分子量为4128.10，与环肽的理论值相符。活性检测表明含有重组环肽RCBAY的制备产物与直链肽RMBAY相比，降血糖的作用更显著和持久。本研究提示RCBAY可能成为治疗Ⅱ型糖尿病的更有效的药物。 在实验室水平确定工程菌RMBAY-ER2566的生长曲线，碳源，IPTG诱导时OD600，IPTG用量和诱导时间等参数。初步的探索结果表明：培养菌体至OD600达到0.5-1.0时加入IPTG至工作浓度0.4mmol／L，30℃诱导表达3-4h，或37℃诱导表达2-3h，均能有保证目的蛋白的高效表达。葡萄糖作为碳源抑制目的蛋白的表达。以实验室研究为参考，利用5L发酵罐发酵，3.5L发酵液收获湿重为113g的菌体，其中目的蛋白表达量达到30-35％，可溶性成分占可溶性蛋白的28-30％。工程菌RMBAY-ER2566的发酵为开展RMBAY作为VPAC2型受体特异激动剂的生物学研究及其医学应用奠定基础。 总体上，本文主要利用基因工程原理和技术，结合蛋白内含肽可诱导剪切功能实现重组PACAP及其衍生多肽的高效制备；筛选并鉴定一条可高效协助机体降低血糖的新型VPAC2受体特异激动剂——RMBAY；尝试通过环化提高其活性和稳定性；开展工程菌中试发酵的研究；为具有自主知识产权的VPAC2受体特异激动剂的研究和开发奠定基础。
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