补肾通络方对骨质疏松斑马鱼效应评价及破骨细胞自噬机制

作者：谭登; 张玉; 张农山; 刘军; 万仕炜; 韩龙; 方彭华; 闵文^*

来源：中国实验方剂学杂志, 2020, 26(07): 79-85.

DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20200641

• 斑马鱼
• 骨质疏松
• 补肾通络方
• 破骨细胞
• 自噬

目的:评价补肾通络方对斑马鱼骨质疏松模型的干预效应,并明确其对破骨细胞分化的自噬调控机制。方法:选取新生3 d健康斑马鱼幼鱼260尾,25 mmol·L-1泼尼松龙(Pred)干预3 d,通过钙黄绿素染色确认建模成功,分为空白组,Pred组(25 mmol·L-1),依替磷酸二钠组(300 mg·L-1),补肾组(180 mg·L-1),通络组(30 mg·L-1)和补肾通络组(210 mg·L-1)各40尾。药物干预4 d后采用钙黄绿素染色后拍照,统计斑马鱼脊椎骨荧光面积;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测斑马鱼碱性磷酸酶(ALP),骨形态发生蛋白-2b(BMP-2b),Runt相关转录因子2(Runx2),组织蛋白酶K(CTSK),抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)及活化T细胞核因子(NFATC-1)mRNA表达。培养RAW264.7细胞至80%～90%密度后分为空白组,Rankl诱导组(10μg·L-1),补肾组(180 mg·L-1),通络组(30 mg·L-1)和补肾通络组(210 mg·L-1)。经Rankl诱导细胞破骨分化及药物干预4 d后,采用FITC标记鬼笔环肽染色检测肌动蛋白环表达,Real-time PCR检测RAW264.7细胞TRAP,CTSK和自噬相关基因5(ATG5),自噬相关基因7(ATG7),泛素结合蛋白62(p62)mRNA表达。结果:在体内研究中,与空白组比较,Pred组斑马鱼椎骨面积及ALP,BMP-2b,Runx2表达显著下降(P<0.01),CTSK,TRAP,NFATC-1表达显著升高(P<0.01)。与Pred组比较,通络组椎骨面积明显增加(P<0.05),而补肾通络组椎骨面积显著增加(P<0.01),补肾组,通络组及补肾通络组ALP,BMP-2b,Runx2表达均显著升高(P<0.01),补肾通络组CTSK,TRAP,NFATC-1表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。体外研究显示,与空白组比较,Rankl诱导组肌动蛋白环数目显著增多(P<0.01),CTSK,TRAP和ATG5表达显著升高(P<0.01),ATG7,p62表达明显升高(P<0.05)。与Rankl诱导组比较,补肾组、通络组及补肾通络组均明显减少了肌动蛋白环数目及CTSK,TRAP表达(P<0.05,P<0.01),而补肾通络组同时降低了ATG5,ATG7,p62表达(P<0.05,P<0.01)。结论:补肾通络方能够显著改善泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松症,并通过降低自噬相关基因表达抑制破骨细胞分化。

• 单位
  南京中医药大学; 南京中医药大学翰林学院