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摘要
嗜热酸性III型普鲁兰水解酶TK-PUL在“液化糖化一步法”的淀粉制糖工艺中具有巨大的应用潜力，也可作为模板研究III型普鲁兰多糖水解酶以单一活性中心同时水解α-1，4-糖苷键和α-1，6-糖苷键的双功能催化机制。本研究对TK-PUL保守基序中非保守氨基酸残基进行定点突变，通过比较TK-PUL与突变体的酶学性质，确定保守基序中关键氨基酸残基对其催化性质的影响。TK-PUL保守基序II中I500W位点变化不影响其最适反应pH、pH稳定性、最适反应温度、热稳定性，但使其α-淀粉酶活性和普鲁兰酶活性均明显降低。动力学常数测定结果显示，突变体I500W以麦芽三糖为底物的k_(cat) / K_(m)值基本不变，以异潘糖为底物的k_(cat) / K_(m)值约为TK-PUL的64.78%。本研究结果表明，TK-PUL保守基序II中第500位氨基酸残基Ile对其水解糖苷键的偏好性起到重要作用。TK-PUL中I500W位点变化不影响其α-1，4-糖苷键水解活性，但使其α-1，6-糖苷键水解活性明显降低。本研究有助于深入理解TK-PUL的双功能催化机制，也可为TK-PUL的分子改造提供理论依据和设计思路。
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