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摘要
目的通过实验研究胆道闭锁(biliary atresia, BA)患儿总胆固醇(total cholesterol, TC)对胆管损伤的影响, 并探讨其免疫学机制。方法回顾性收集2011—2020年间广州市妇女儿童医疗中心收治的118例经术中胆管造影确诊的BA患儿、80例同龄婴儿肝炎综合征(infantile hepatitis syndrome, IHS)患儿以及165例无肝病学证据且无肝功能异常的同龄正常对照(normal control, NC)儿童外周血TC含量。分析TC与胆管损伤各指标及多种与BA形成相关免疫细胞之间的关联。在体外CD177+中性粒细胞与胆道上皮细胞(biliary epithelial cell, BEC)共培养体系中加入胆固醇, 观察其对BEC凋亡的影响, 同时观察加入胆固醇刺激后CD177+中性粒细胞内相关指标的变化;根据外周血TC检测数值将BA患儿分为高胆固醇BA组、正常胆固醇BA组, 通过RNA测序分析, 比较高胆固醇组、正常胆固醇组BA患儿CD177+中性粒细胞基因表达差异。结果 BA患儿外周血TC含量为4.9(4.0, 6.1)mmol/L, 高于NC组的3.7(3.1, 4.1)mmol/L及IHS组的4.2 (3.3, 5.4)mmol/L, 差异有统计学意义(P<0.05);BA患儿外周血TC含量[4.9(4.0, 6.1)mmol/L]与胆管损伤指标γ-谷氨酰转移酶(gamma-glutamyltransferase, GGT)含量[497.0(298.5, 843.0)U/L]呈正相关(r=0.401, P<0.05), 同时与直接胆红素(direct bilirubin, DBIL)、总胆汁酸(total bile acid, TBA)含量呈正相关(r=0.338, P<0.05;r=0.235, P<0.05);在肝脏组织胆管细胞凋亡数量比例层面, 高胆固醇BA组为0.724±0.146, 正常胆固醇BA组为0.232±0.141, NC组(患儿年龄相近门静脉海棉样变儿童)为0.242±0.228, 高胆固醇BA组与其余两组间差异有统计学意义(P<0.05);BA患儿外周血TC含量[4.4(3.1, 5.5)mmol/L]与外周血CD177+中性粒细胞比例[(26.5±6.4)%]呈正相关(r=0.503, P<0.05), 与外周血单核细胞[1.0(0.8, 1.2)×109/L]、中性粒细胞[(3.2±1.4)×109/L]无相关性(P>0.05); BA患儿外周血TC含量[(4.7±1.6)mmol/L]与外周血T细胞数量(4 952.1±1 985.0)个/μL呈正相关(r=0.488, P<0.05), 与外周血B细胞971.0(664.8, 1 636.1)个/μL无相关性(P>0.05);与正常胆固醇BA组相比, 高胆固醇BA组线粒体氧化磷酸化相关基因(CYBB、CALR、MT-CYB、MT-ND5、MT-ND1)表达显著上调, 差异有统计学意义(P<0.05);在胆固醇刺激下, CD177+中性粒细胞中代表线粒体氧化磷酸化的指标TOMM20及DNA 8-OHdG的平均荧光强度分别为73.47±6.36、159.07±10.17, 较刺激前差异有统计学意义(P<0.05), 而CD177+中性粒细胞胞外诱捕网指标MPO和H2B分别为60.51±4.26、157.46±9.40, 较刺激前差异有统计学意义(P<0.05);同时在CD177+中性粒细胞与BEC共培养体系中, 加入胆固醇刺激后BEC细胞活率较刺激前差异有统计学意义(P<0.05)。结论胆道闭锁中胆固醇可上调CD177+中性粒细胞线粒体氧化磷酸化水平, 促进胞外诱捕网的释放, 引起胆管损伤。
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