肾癌786-O细胞B4GALNT1基因RNA干扰模型构建与鉴定

作者：夏樾^*; 钱辉军; 陕光

来源：现代泌尿生殖肿瘤杂志, 2020, 12(03): 173-177.

• 肾癌
• β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶1
• 慢病毒载体
• 增殖

目的构建靶向抑制β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶1(B4GALNT1)基因表达的shRNA慢病毒载体,稳定转染至人肾癌细胞株786-O中,观察转染后抑制效率及对786-O细胞增殖活性的影响。方法构建特异性靶向抑制B4GALNT1基因表达的shRNA慢病毒载体(shB4GALNT1),通过琼脂糖凝胶电泳和阳性克隆测序鉴定载体的构建;慢病毒包装并稳定转染至肾癌786-O细胞中,通过荧光显微镜观察shRNA转染细胞;实验分为3组:空白对照(NC)组、转染空载体(VC)组和转染shB4GALNT1(KD)组,分别通过Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应来证实转染shB4GALNT1在蛋白与mRNA表达水平的抑制效率;通过Celigo全视野细胞扫描分析抑制B4GALNT1表达对786-O细胞增殖活性的影响。结果琼脂糖凝胶电泳证实阳性克隆为341bp,阳性克隆测序证实B4GALNT1shRNA慢病毒表达载体构建成功;绿色荧光蛋白表达证实B4GALNT1shRNA慢病毒表达载体转染至肾癌786-O细胞中;NC组、VC组和KD组B4GALNT1蛋白的相对表达量分别为1.013±0.057、0.916±0.055、0.340±0.030,KD组与VC组比较差异有统计学意义(P<0.01),B4GALNT1蛋白表达抑制率达63%,NC组与VC组比较差异无统计学意义(P>0.05);NC组、VC组和KD组B4GALNT1 mRNA的相对表达量分别为1.021±0.078、1.002±0.074、0.078±0.027,KD组与VC组比较差异有统计学意义(P<0.01),表达抑制率达92%,NC组与VC组比较差异无统计学意义(P>0.05);转染后第2～5天,抑制B4GALNT1表达可显著降低786-O细胞增殖活性(P<0.01)。结论本实验成功构建RNA干扰靶向抑制B4GALNT1基因的慢病毒表达载体,并稳定转染人肾癌786-O细胞,抑制B4GALNT1表达可显著降低细胞增殖活性。

• 单位
  武汉大学人民医院